Аффинность антител что это
аффинность антител
Смотреть что такое «аффинность антител» в других словарях:
аффинность антител — Мера прочности связывания активных зон антител с реакционноспособными группами антигена; А.а. является главной характеристикой специфичности антител и определяет уровень их авидности; количественно А.а. выражается константой равновесия реакции… … Справочник технического переводчика
АФФИННОСТЬ — антител (от лат. affinis родственный), прочность связывания активных центров молекулы антитела с детерминантными (реакционно способными) группами антигена; осн. характеристика специфичности антител. Зависит от взаимной пространственной… … Биологический энциклопедический словарь
Аффинность — (лат. affinitas родственность) термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия веществ (например, антигена и антитела).[1] Аффинность можно определить по закону действующих масс как отношение… … Википедия
Антитела — I Антитела белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование, или с изолированной детерминантной … Медицинская энциклопедия
antibody affinity — antibody affinity. См. аффинность антител. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.
Антитела — Эта статья об иммунологии. Об украинской поп рок группе см. Антитела (группа); о фильме см. Антитела (фильм, 2005). Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) это особый класс гликопротеинов, присутствующих на… … Википедия
Авидность — антител характеристика общей стабильности комплекса антигена и антитела. Авидность определяется аффинностью антитела к антигену, количеством антигенсвязывающих центров в молекуле антитела и особенностями пространственной структуры антигена … Википедия
Белки — У этого термина существуют и другие значения, см. Белки (значения). Белки (протеины, полипептиды[1]) высокомолекулярные органические вещества, состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью альфа аминокислот. В живых организмах… … Википедия
Артериола — Артериолы мелкие артерии, по току крови непосредственно предшествующие капиллярам. Характерная их особенность преобладание в сосудистой стенке гладкомышечного слоя, благодаря которому арте … Википедия
Общее периферическое сосудистое сопротивление — Артериолы мелкие артерии, по току крови непосредственно предшествующие капиллярам. Характерная их особенность преобладание в сосудистой стенке гладкомышечного слоя, благодаря которому артериолы могут активно менять величину своего просвета и,… … Википедия
Авидность антител в диагностике инфекционных заболеваний
Расширение возможностей в лечении и профилактике инфекционных заболеваний нуждается в быстрой и точной диагностике. Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические (профилактические) мероприятия. Установление первичного инфицирования возбудителями внутриутробных инфекций играет существенную роль в предотвращении врожденных патологий.
Традиционные иммунодиагностические методы, используемые для серологической диагностики острой фазы вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, имеют ряд ограничений. Часто невозможно провести четкую дифференциацию между первичной инфекцией, реинфекцией или обострением инфекционного процесса, особенно при серодиагностике инфекций с нетипичной динамикой антителообразования, когда наличие иммуноглобулинов класса М (IgM) не является достоверным и достаточным признаком для дифференциации стадий заболевания.
Определение IgM, как показателя первичной инфекции, в ряде случаев утратило свое значение, так как было доказано, что их можно выявить в сыворотке периферической крови спустя месяцы или даже годы после наступления сероконверсии (так называемые хронические IgM). Кроме того, выявление IgM может дать ложнопозитивные результаты. Например, вследствие вторичной инфекции (экзогенная реинфекция или эндогенная реактивация инфекции). Было показано, что специфические IgA также могут присутствовать в сыворотке периферической крови через 2-3,5 года с момента зарегистрированной сероконверсии.
Серологическая диагностика, основанная на определении титра специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) может быть полезной при дифференциации активного периода болезни от перенесенной в прошлом и уже неактивной инфекции. Однако этот метод имеет ряд ограничений: не позволяет дифференцировать первичную и реинфекцию; у пациентов с реактивацией хронического процесса не всегда наблюдается достоверный рост уровня IgG; метод экономически невыгоден.
Для того, чтобы установить точный момент инфицирования и разграничивать первичную, реинфекцию или реактивацию инфекционного процесса, был предложен тест на определение авидности IgG антител.
Различают два понятия: аффинность антител (или аффинитет) и авидность (или авидитет).
Аффинность — это степень специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте. Авидностью антител или функциональной аффиностью называется прочность связи между антителом и антигеном. Величина авидности зависит от аффиности специфических антител (выше аффиность — выше авидность) и количества связывающих центров. Первичный иммунный ответ на ранее не встречаемые организмом антигены начинается с продукции иммуноглобулинов класса М. Специфические IgG появляются позже. При первичном иммунном ответе они сменяют ранние антитела IgM и накапливаются в организме в больших количествах.
Под воздействием антигена происходит процесс отбора и стимуляции В-клеток, что приводит к увеличению аффинности IgG антител, низкой после первого контакта с антигеном и возрастающей в течение последующих недель или месяцев (от 1 до 7).
Соматические мутации в генах, кодирующих вариабельные участки IgG, приводят к возрастанию прочности связывания в комплементарных участках антигенов и антител. В конце первого месяца после инфицирования вариабельные участки антител становятся более специфичными по отношению к антигену, и аффинность IgG антител возрастает. Этот процесс называют «созреванием» (от maturation — созревание) антител. Высокоаффинные антитела остаются в организме длительное время. За счет этих антител развивается быстрый вторичный иммунный ответ в случае повторного попадания возбудителя в организм.
Под воздействием антигена происходит процесс отбора и стимуляции В-клеток, что приводит к увеличению аффинности IgG антител, низкой после первого контакта с антигеном и возрастающей в течение последующих недель или месяцев (от 1 до 7). Соматические мутации в генах, кодирующих вариабельные участки IgG, приводят к возрастанию прочности связывания в комплементарных участках антигенов и антител. В конце первого месяца после инфицирования вариабельные участки антител становятся более специфичными по отношению к антигену, и аффинность IgG антител возрастает. Этот процесс называют «созреванием» (от maturation — созревание) антител. Высокоаффинные антитела остаются в организме длительное время. За счет этих антител развивается быстрый вторичный иммунный ответ в случае повторного попадания возбудителя в организм.
Уровень авидности пропорционален дозе и природе антигена, а также индивидуальному уровню соматических мутаций. Низкие дозы антигена приводят к более быстрому возрастанию авидности, а высокие дозы — к более медленному. Таким образом, низкоавидные антитела продуцируются в течение первой стадии инфекции, когда содержание антигенов обычно высокое.
С возрастом эффективность селекции специфических антител падает, а следовательно процесс созревания антител замедляется, этим объясняется меньшая устойчивость к инфекциям лиц старше 60-65 лет и неэффективность вакцинации в этом возрасте. Выявление в испытуемой сыворотке антител с индексом авидности ниже 15-50% (у разных производителей и разных возбудителей этот показатель разный и указывается в бланке исследования) указывает на свежую первичную инфекцию. Показатель авидности. равный или превышающий 50%, свидетельствует о наличии в сыворотке высокоавидных антител — маркеров перенесенной в прошлом инфекции или персистирующей инфекции. Показатель авидности антител в интервале 31-49% может свидетельствовать о поздней стадии первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции только при условии выявления антител в высокой концентрации. Интерпретацию результатов определения индекса авидности необходимо проводить в соответствии с рекомендациями фирмы — производителя, так как величина ИА для одной и той же стадии заболевания может колебаться в широких пределах.
Если в исследуемой сыворотке крови при наличии или отсутствии IgM обнаруживаются IgG с низкой авидностью, то это свидетельствует о первичной (недавней) инфекции. Наличие же высокоавидных антител IgG говорит о вторичном иммунном ответе в случае попадания возбудителя в организм или обострения (реактивации).
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОАВИДНЫХ АНТИТЕЛ
Применение метода определения авидности антител представляет интерес при диагностике инфекций.
Краснуха обладает бесспорным тератогенным действием, т.е. приводит к формированию пороков развития эмбриона и плода. У беременных краснуха может протекать тяжело, легко и бессимптомно. Внутриутробное заражение плода возможно при любой форме краснушной инфекции. Распознавание инфекции, особенно в период вспышек, больших затруднений не вызывает.
Однако для точной диагностики необходимо выделение вируса, которое технически не всегда выполнимо. Лабораторная диагностика обычно заключается в определении IgG и IgM антител, в основном у беременных, так как риск рождения неполноценного или мертвого ребенка у инфицированной матери очень высок и обычно рекомендуется прерывание беременности. Однако диагностика, основанная на определении антител, может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Так, при повторной инфекции у вакцинированных, которая может произойти в случаях низкого иммунного ответа при вакцинации, или может быть вызвана мутантными штаммами вируса, IgM антитела не образуются, возрастание титров IgG антител также наблюдается не всегда. У новорожденных с первичной инфекцией вследствие внутриутробного инфицирования, IgM антитела могут не синтезироваться в силу ряда причин:
незрелость иммунной системы; блокирование вирусного антигена материнскими антителами; инфицирование на поздних стадиях беременности; иммунная толерантность. Если происходит стимуляция клонов лимфоцитов вируса краснухи, может возникать ложноположительный антительный ответ, особенно для антител класса IgM. Было показано, что IgM антитела могут персистировать в течение года или возникать в случаях реинфекции, особенно у иммунодепрессивных пациентов. Кроме того, могут возникать ложноположительные результаты вследствие наличия ревматоидного фактора или подобных соединений, даже в ловушечном варианте теста. Только определение низкоавидных антител может быть диагностическим маркером первичной инфекции вирусом краснухи, что особенно важно при диагностическом обследовании беременных, когда необходимо дифференцировать первичную инфекцию от вторичной или реактивации инфекции.
Токсоплазмоз. Известно, что проявление клинических симптомов при приобретенном токсоплазмозе имеет низкое диагностическое значение для точного определения длительности инфекционного процесса.
Увеличение лимфоузлов может возникать в разное время с момента первичной инфекции, а нередко может сохраняться длительное время или даже возобновляться в более поздний период болезни, независимо от применения специфического противопаразитарного лечения.
До настоящего времени единственными доступными серологическими тестами для определения острой фазы токсоплазмоза являлись определение IgM антител и определение IgG антител в возрастающих титрах в двух или трех образцах сывороток, что, однако, приводит к задержке постановки диагноза. Кроме того, у пациентов с реактивацией хронического токсоплазмоза значительный рост уровня антител IgG отмечается не всегда, особенно это касается детей и подростков с поражением глаз при врожденном токсоплазмозе.
Интерпретация результатов исследований других иммуноглобулинов также вызывает затруднения. Основной недостаток определения IgM антител — длительная персистенция в крови, в связи с чем возникают трудности в установлении окончания острой фазы заболевания. У 40% пациентов IgM антитела выявляются в течение года с момента заражения при использовании ИФА, у 60% — при использовании высокочувствительного метода иммуноадсорбции. Также как IgM, специфические IgA присутствовали в сыворотке периферической крови через 45 месяцев с момента зарегистрированной сероконверсии, в течение 2-летнего периода серологического наблюдения и через 8 месяцев с момента появления признаков лимфоаденопатии. С другой стороны, у определенных категорий пациентов, например у детей, IgM антитела вообще не образуются.
Определение авидности IgG антител является высокоспецифичным и чувствительным методом диагностики острого первичного токсоплазмоза, что особенно важно при обследовании беременных для устранения потенциального риска появления врожденного токсоплазмоза у детей.
Недавно была разработана методика измерения антигенсвязывающей авидности (функциональной аффинности) IgG антител к Toxoplasma gondii, позволяющая разделить низкоаффинные антитела от высокоаффинных, которые указывают на перенесенную в прошлом инфекцию. С помощью этой методики первичная инфекция может быть идентифицирована с использованием единственной порции сыворотки.
Инфекции, вызываемые вирусом простого герпеса. Частота инфицирования новорожденных у женщин субклинической формой простого герпеса составляет 3-5% при хронической инфекции и доходит до 30-50% при заражении во время беременности (первичная инфекция). Инфекции, вызываемые вирусами простого герпеса, цитомегаловирусом относятся к инфекциям с нетипичной динамикой антителообразования (когда наличие IgM не является достоверным и достаточным признаком для дифференциации стадий заболевания). Определение IgM антител может давать ложноотрицательные результаты, поскольку они могут вообще не образовываться, или присутствовать в количествах, трудных для определения.
Ложноположительные результаты могут возникать по следующим причинам: длительная персистенция IgM антител или их присутствие может быть не связано с инфекцией; IgM антитела могут определяться при реактивации инфекции или при вторичной инфекции, например, вирусом иммунодефицита человека; различные вирусы могут иметь общие эпитопы (например, вирус простого герпеса и вирус варицелла-зостер), что приводит к возникновению перекрестных реакций. Диагностика активной фазы инфекции по 4-кратному возрастанию титра IgG также может вызывать затруднения, поскольку титр IgG антител может увеличиваться достаточно быстро (в течение 1-2 суток) после проявления симптомов заболевания.
Таким образом, определение серологических маркеров этих инфекциях не может служить специфичным тестом для дифференциации между первичной инфекцией и реактивацией. Заражение вирусом простого герпеса (ВПГ) ведет к пожизненной персистенции с возможностью реактивации вируса и перекрестного заражения другим серотипом ВПГ. Преобладание хронических и бессимптомных форм течения болезни, а также возможность атипичных проявлений ставит под сомнение диагностику по внешним признакам. Приблизительно 20% больных ВПГ-2 не имеют симптомов вообще, а 60% лиц имеют признаки, которые невозможно диагностировать и которые не принимаются врачом и самими больными за герпес (нетипичные проявления). Обе эти группы имеют риск заразить своих партнеров. Специфические IgM не могут быть использованы в качестве достоверного маркера для диагностики острой и, особенно, первичной инфекции, так как IgM к ВПГ могут образовываться как при первичном инфицировании, так и при реинфекции и реактивации вируса, но в то же время они способны вырабатываться в достаточном для диагностики количестве только у 30% людей.
Единственным способом, позволяющим сразу и достоверно диагностировать первичную инфекцию, является определение индекса авидности специфических антител.
Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) — самая распространенная внутриутробная инфекция и одна из наиболее частых причин невынашивания беременности. Риск внутриутробного инфицирования и характер поражения плода зависят от наличия антител у матери и срока инфицирования плода. При первичном инфицировании серонегативной беременной риск передачи плоду составляет примерно 50%.
Диагностика первичной ЦМВИ обычно основывается на определении сероконверсии, наличия высокого титра специфичных IgM или четырехкратного возрастания титра специфических IgG. В связи с тем, что момент сероконверсии и возрастание титров IgG диагностировать достаточно трудно, IgM антитела являются наиболее часто используемым маркером для диагностики острой инфекции. Однако у некоторых больных IgM антитела сохраняются длительное время, что приводит к гипердиагностике острой инфекции.
Определение авидности антител IgG рассматривается как наиболее важный серологический маркер, поскольку низко- и высокоавидные антитела IgG доминируют соответственно при недавней или длительно текущей инфекции.
Использование теста на авидность IgG при позитивной реакции на IgM антитела помогает подтвердить или исключить наличие первичной ЦМВИ и в ряде случаев помогает избежать необоснованных инвазивных процедур.
Вирусный гепатит С. Лабораторная диагностика гепатита С (ВГС) основана на выявлении специфических маркеров инфицирования (IgM и IgG антитела к ВГС, РНК ВГС). lgM-ответ в острой фазе гепатита С не следует классическому пути антителообразования: IgM анти-HCV могут выявляться одновременно и даже позднее, чем анти-ВГС класса IgG. Поэтому обнаружение IgM анти-ВГС не может быть использовано как маркер острой HCV-инфекции. Вместе с тем, длительность циркуляции антикор-lgM (3-5 месяцев) является фактором, прогнозирующим персистентную инфекцию, а их появление при хроническом гепатите С свидетельствует о реактивации вируса, т.е. об обострении процесса. Единственным достоверным фактором подтверждения первичной инфекции ВГС является сероконверсия.
Индекс авидности IgG при первичной ВГС инфекции имеет низкие значения и возрастает с течением времени, что подтверждает целесообразность использования определения авидности IgG антител для дифференциальной диагностики первичной инфекции от хронической или перенесенного гепатита С.
Сдавайте анализы постоянно в одной и той же лаборатории – и вашему врачу будут примерно известны Ваши личные показатели нормы и любое отклонение от нормы будет сразу им замечено.
Биотехнология антител
Автор
Редакторы
Первые статьи спецпроекта о терапевтических антителах были посвящены истории открытия и применения антител, их структуре и разнообразию. В этом тексте мы затронем то, как ученые научились производить антитела для лекарственного применения, а также модифицировать их. Поскольку антитело — очень сложная молекула, обладающая пространственной структурой, определяющей ее функцию, — антитело нельзя синтезировать химически, а нужно обязательно использовать для этого биологические системы, например, клеточные культуры животных, в которые заложены все необходимые средства для производства таких сложных белков. В этой статье мы рассмотрим современные подходы в биоинженерии антител.
Терапевтические антитела
Спецпроект об антителах, истории их изучения, методах работы с ними, а также о применении антител в современной медицине и биотехнологии.
Партнер спецпроекта — Департамент вычислительной биологии одной из крупнейших российских биотехнологических компаний — BIOCAD. BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.
В первой статье спецпроекта — «Краткая история открытия и применения антител» [1] — рассказывается о том, как: были открыты антитела; возникла идея их использования в диагностике и терапии; были разработаны методы получения высокоочищенных моноклональных антител; антитела применяются в лабораторной и медицинской диагностике; а также о наиболее успешных терапевтических антителах. Вторая статья — «Антитело: лучший способ распознать чужого» [2] — посвящена устройству антител и механизму их образования в организме. В третьей статье цикла мы расскажем о том, как биотехнологи создают антитела к нужным мишеням: о генной инженерии антител, создании их «с нуля», оптимизации структуры и производстве в клеточных культурах животных (рис. 1).
Рисунок 1. Общая схема разработки антитела
Для того чтобы клетка производила антитело, необходимо ввести в нее гены, кодирующие его тяжелые и легкие цепи. Также нужно, чтобы генетическая конструкция, которая вводится в клетку (ее называют вектором), содержала ряд вспомогательных элементов, обеспечивающих наиболее эффективную транскрипцию и трансляцию гена в клетке (рис. 2). Уже на данном этапе необходимо продумать весь путь разработки антитела вплоть до выхода на рынок. Для этого еще на стадии конструирования антитела создают Target product profile — документ, который со временем превратится в инструкцию к препарату. Именно он определяет, каким пациентам будет показано антитело, с какой частотой оно будет вводиться, а значит, каков должен быть его формат и другие параметры, о которых мы расскажем ниже.
Технологическая платформа MabNext компании BIOCAD
В компании BIOCAD создана технологическая платформа MabNext для ускорения разработки моноклональных антител. Компания открыла собственный центр обработки данных (ЦОД), чтобы как можно более эффективно предсказывать свойства антител и оптимизировать их структуру на собственных вычислительных мощностях. Так, если раньше на сбор информации и краткое описание аминокислотной последовательности целевых антител для лечения заболеваний уходило более двух недель, то теперь с помощью новых вычислительных мощностей на это будет тратиться всего несколько десятков минут.
В разработке компании более 30 препаратов — моноклональных антител для терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний. Среди них российские антитела, успешно прошедшие первые клинические испытания, в том числе PD-1 (фаза 2), IL-17 (фаза 3), IL-6R (фаза 2), CTLA-4 (фаза 1), и антитела на более ранних фазах исследований — биспецифические PDL1/CD47, cMET/EGFR, PCSK9 (доклинические исследования), IL-5R.
Материал предоставлен партнёром — Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD
Путем изменения генетических конструкций, кодирующих антитело, можно влиять на такие его характеристики, как способ действия (будет оно убивать клетку-мишень или только препятствовать проведению сигнала), селективность к мишени, время выведения из организма и др. Если необходимо модифицировать специфичность или селективность антитела (выделенные жирным термины см. в «Словарике»), то изменению подлежат вариабельные фрагменты антител, отвечающие за связывание с антигеном (Fab-фрагменты). Если же нужно изменить другие параметры — время полужизни антитела, его механизм действия, — модифицируют константные участки (Fc-фрагмент).
Генная инженерия антител
Обычно создание генно-инженерной конструкции для экспрессии антитела начинается с выбора системы экспрессии, вектора и оптимизации нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело. Необходимо откорректировать состав кодонов таким образом, чтобы экспрессия антитела была максимальной. Аминокислотный состав белка оптимизируют для снижения вероятности выпадения в осадок, агрегации, а также иммуногенности, о чем мы подробнее расскажем далее. Кроме того, важно обеспечить правильное сворачивание (фолдирование, упаковку) цепей и их соединение между собой. Сейчас существуют программы, позволяющие оптимизировать нуклеотидную последовательность генно-инженерных конструкций для продукции антител in silico, хотя, конечно, последнее слово остается за экспериментальными данными.
В качестве вектора используют плазмиды — кольцевые ДНК, кодирующие как сам ген белка, так и вспомогательные элементы. Так, для экспрессии в эукариотических клетках используют промотор цитомегаловируса (CMV), обеспечивающий высокую эффективность транскрипции.
Поскольку антитело состоит из двух полипептидных цепей — легкой и тяжелой, — используют либо двухплазмидную систему экспрессии, либо один вектор, содержащий оба гена. Последний вариант предпочтительнее, так как позволяет точнее контролировать соотношение продукции легких и тяжелых цепей. Было показано, что в природных условиях в B-клетках легкие цепи синтезируются в бóльшем количестве, чем тяжелые, и такое соотношение скоростей синтеза наиболее благоприятно для продукции антител [3].
О том, как и зачем ученые работают с клеточными культурами, мы рассказывали в статье «12 методов в картинках: клеточные технологии» [4]. — Ред.
Рисунок 2. Схема плазмиды для экспрессии антител в клетках млекопитающих
Получение вариабельных фрагментов антител
Перейдем к тому, как получаются последовательности вариабельных фрагментов антител, которые и определяют их специфичность и селективность.
Исследователи пока не могут предсказать, какая именно последовательность вариабельного фрагмента антитела будет оптимальной для связывания антигена. Антиген, как правило, представляет собой белковую молекулу, и площадь поверхности контакта антитела с антигеном слишком велика для моделирования in silico (рис. 3), которое также осложняется наличием молекул воды. Поэтому приходится использовать биологические объекты, у которых есть способность очень тонко настраивать последовательность аминокислот антитела для обеспечения высочайшей аффинности к антигену.
Биологические процессы настолько сложны, что порой их намного удобнее смоделировать на компьютере, нежели пытаться повторить в пробирке. О том, как устроена работа биоинформатика, мы уже писали в статьях «12 методов в картинках: сухая биология» [5], «Вычислительное будущее биологии» [6] и в других [7–9]. — Ред.
Рисунок 3. Кристаллическая структура комплекса антитела 11К2 (серый, розовый и желтый цвета) и антигена MCP-1 (зеленый цвет) в двух проекциях. Структура иллюстрирует сложность поверхности контакта антитело—антиген.
Методы получения антител подразделяются на гибридомные и дисплейные. Гибридомный метод, более подробно описанный в статьях «Краткая история открытия и применения антител» [1] и «Моноклональные антитела» [10], использует для получения антител организм млекопитающего, который после иммунизации (введения антигена) вырабатывает антитела с высокой аффинностью и селективностью. В дальнейшем эти антитела или их гены можно выделить, отсеквенировать [11] и модифицировать с целью придания им нужных фармакологических свойств.
Дисплейные методы
Дисплейные методы используют в качестве исходного материала широкий репертуар генов, кодирующих антитела. Самым распространенным методом является фаговый дисплей [12], [13]. Метод представления (отсюда название — «дисплейный») пептида на поверхности бактериофага М13 был изобретен в 1985 году. В 1989 г. научились клонировать гены иммуноглобулинов, что позволило обойтись без гибридомной технологии для получения антител. Первоначально в бактериях синтезировали Fab или scFv фрагменты антител, создавая библиотеки клонов, и проводили вручную отбор наиболее аффинных клонов с помощью радиоактивно-меченного антигена. Однако это была очень трудоемкая и неэффективная процедура. В 1990 году впервые использовали дисплейную технологию представления фрагментов антител на поверхности фагов, а в 1991 создали первую библиотеку вариабельных фрагментов. Первым антителом, созданным с помощью технологии фагового дисплея, стала «Хумира» (адалимумаб компании Abbott) против мишени TNF для лечения ревматоидного артрита [14] и болезни Крона. «Хумира» зарегистрирована в 2002 году, и уже долгое время возглавляет список лекарств — лидеров продаж.
Получение антитела дисплейным методом in vitro схематически подражает эволюционному процессу формирования антител в организме [15]:
Таким образом, в процессе присутствуют все составляющие эволюции — наследственность, изменчивость и отбор. Рассмотрим эти шаги подробнее.
Качество получаемой библиотеки фрагментов зависит от способности получить широкий репертуар разнообразных и при этом качественных антител [16]. Существует два принципиально разных подхода к получению библиотек: естественный (наивный) и синтетический.
Естественные библиотеки вариабельных доменов антител получают методом полимеразной цепной реакции природных генов с обратной транскрипцией (RT-PCR) [17] из лимфоидных тканей или периферической крови людей, а также других животных. Преимущество этого метода в том, что полученные антитела будут в правильной конформации, так как их гены кодируют функциональные антитела. Однако недостаток в том, что разнообразие последовательностей ограничено охватом естественной иммунной системы, в которой существует определенная неравномерность использования тех или иных последовательностей. Также фрагменты из природных библиотек сильно отличаются по качеству и непредсказуемы по составу; многие из них могут оказаться недостаточно стабильными или неподходящими по другим причинам. Репертуар естественных библиотек составляет 10 7 –10 11 фрагментов [18].
Синтетические библиотеки создают путем встраивания искусственно синтезированной ДНК в последовательности, кодирующие вариабельные домены. ДНК синтезируется таким образом, чтобы вносить совершенно случайные (рандомизированные) мутации в получающиеся фрагменты антител и тем самым расширять разнообразие определяющего комплементарность сайта (complementarity-determining region, CDR). Синтетические библиотеки позволяют использовать определенную коровую (germline) структуру вариабельного домена, про которую известно, что она наиболее представлена в каждом индивидууме, неиммуногенна и стабильна. Однако введение полностью синтетических участков CDR может привести к неправильному сворачиванию и агрегации белка. Потребовалось время для отработки подходов к определению того, какие CDR лучше использовать. Репертуар синтетических библиотек, как правило, доходит до 10 9 –10 11 фрагментов.
Далее начинается самое интересное: как дисплейная технология позволяет связать генотип с фенотипом и отобрать клоны с нужными свойствами. Гены всех фрагментов антител вставляют в геном бактериофага в одно и то же положение — внутрь гена, кодирующего белок оболочки фага. Потом гены переносят в кишечную палочку Escherichia coli (это называется трансдукцией) и заражают вспомогательным фагом, который вызывает сборку бактериофага, содержащего на поверхности фрагмент антитела. В результате получается библиотека бактериофагов, у каждого из которых на поверхности экспрессируется фрагмент антитела, соответствующий гену, который попал в данного бактериофага. Препарат библиотеки добавляют к иммобилизованному на поверхности пластиковой пробирки антигену, против которого надо создать антитела, и проводят отмывку. На поверхности остаются только бактериофаги, содержащие вставку гена фрагмента антитела с высоким сродством к антигену. Чтобы отобрать самые высокоаффинные клоны, связавшиеся с антигеном, фаги снимают с поверхности и снова заражают ими E. coli (рис. 4). После нескольких этапов отбора ДНК полученных фагов секвенируют и узнают последовательность, кодирующую самые аффинные фрагменты [19].
Рисунок 4. Процесс селекции нужных генотипов в соответствии с аффинностью к антигену. а — Бактериофаг, обеспечивающий связь генотип—фенотип. Ген фрагмента антитела (розовый) вставляется в фаговую ДНК, что приводит к экспрессии на поверхности фага белка — фрагмента антитела. б — Схема фагового дисплея. 1. Фаговую библиотеку, состоящую из 10 6 –10 11 клонов, инкубируют с иммобилизованным антигеном. 2. Не связавшиеся фаги удаляют промывкой. 3. Связавшиеся фаги снимают с поверхности. 4. E. coli заражают фагом для амплификации полученных кандидатов. 5. Клетки высевают на среду с антибиотиком и амплифицируют. Процесс повторяют 2–3 раза для обогащения популяции антительными фрагментами, специфичными к антигену.
Важное преимущество использования дисплейных методов по сравнению с гибридомными — возможность отбирать только те антитела, которые НЕ связываются с ненужными белками, например, с близкими к мишени, но которые не надо блокировать, чтобы не вызывать токсичность. Для этого достаточно иммобилизовать теперь уже нежелательный белок и отбирать те фаги, которые не связались с ним.
Также бывает полезно создать антитело, которое бы хорошо связывалось и с мышиным, и с обезьяньим, и с человеческим вариантами мишени — это обеспечивает быстрое успешное прохождение доклинических исследований и контроль безопасности до выведения потенциального лекарственного кандидата в клинические испытания.
Существуют и другие типы дисплеев, помимо фагового, например, рибосомный или дрожжевой [20]. Здесь я не буду подробно на них останавливаться, так как принцип у них тот же: они обеспечивают связь гена, кодирующего фрагмент антитела, с его аффинностью к мишени, то есть с фенотипом, и позволяют производить отбор по заданным свойствам из огромного количества вариантов в библиотеке.
Созревание аффинности антител
После получения фрагментов-кандидатов разработчики приступают к более сфокусированной настройке аффинности, которая носит название созревание аффинности. В иммунной системе созревание аффинности происходит путем последовательного внесения мутаций в участки, кодирующие CDR, и селективного давления отбора в сторону бóльшей аффинности. In vitro процесс примерно такой же. Разработчики берут ген лидерного кандидата, вносят мутации в положениях соответствующих CDR и проводят скрининг на аффинность. Индивидуальные мутации, усиливающие аффинность, затем объединяют в одном клоне. Рибосомный дисплей позволяет довольно быстро проскринировать миллионы клонов, а использование нескольких раундов отбора имитирует естественный процесс созревания аффинности. В результате получаются антитела с аффинностью даже выше, чем у природных.
Полученная генетическая последовательность фрагмента антитела, содержащая вариабельные домены, объединяется с последовательностью, кодирующей константные участки тяжелой и легкой цепей (Fc-фрагмент). Если оптимизация вариабельного фрагмента касается аффинности и селективности антитела, то Fc-фрагмент отвечает за фармакокинетику и эффекторные функции антитела, о чем я более подробно расскажу далее.
Так выглядит простейшая схема получения антитела, однако на практике разработчики прибегают к модификации и совмещению различных подходов. Расскажу для примера, как была получена молекула уже упомянутой «Хумиры»: за основу взяли тяжелую цепь мышиного антитела против TNF, ее ген скомбинировали с библиотекой человеческих легких цепей и провели селекцию на связывание с человеческим TNF (hTNF). Полученное антитело-кандидат имело аффинность около 15 нМ. Далее провели созревание аффинности, которое позволило добиться аффинности на уровне 300 пМ [21].
Эпитопная специфичность
Если оптимизация аффинности — относительно простая задача, то инженерия эпитопной специфичности может оказаться достаточно трудным делом. От того, с каким участком мишени свяжется антитело, часто зависит итоговый эффект. Особенно это существенно в случае активирующих антител. Однако и для блокирующих антител это тоже важно: например, антитело с тщательно подобранной эпитопной специфичностью может предотвратить связывание мишени с одним из лигандов, не влияя на связывание с другими.
Один из самых ярких примеров важности определенной эпитопной специфичности — антитела против рецептора HER2, который часто повышенно экспрессируется в клетках рака молочной железы и выставляется на их поверхности. Антитело «Герцептин» (трастузумаб компании Roche/Genentech), одобренное в качестве первой линии терапии метастатического рака молочной железы с повышенной экспрессией HER2, связывается с С-концевым доменом HER2 [22], который отвечает за связывание с другим рецептором, HER3, и препятствует активации последнего. Трастузумаб работает только у пациенток с высокой экспрессией HER2, и у большинства впоследствии развивается резистентность к препарату, то есть опухоль снова начинает расти. Компания Roche разработала антитело «Перджета» (пертузумаб), которое связывается с другим эпитопом HER2, отвечающим за его связывание с рядом рецепторов [23]. Пертузумаб предотвращает активацию самого HER2, тем самым позволяя преодолеть резистентность к трастузумабу.
Один из методов создания антител к выбранному эпитопу состоит из двух этапов [24]. На первом этапе проводится скрининг исходной библиотеки антительных фрагментов на связывание с выбранной мишенью, как описано выше. После того, как получены высокоаффинные фрагменты, проводится их скрининг с мутантной мишенью, у которой аминокислотные остатки в области эпитопа заменены на другие, препятствующие связыванию с ним. В ходе скрининга отбираются те антитела, которые НЕ связываются с мутантной мишенью. Это и будут антитела, специфичные к нужному эпитопу.
Антитело против c-Met для терапии эпителиальных опухолей
В компании BIOCAD сочетанием методов иммунизации, фагового дисплея и точечного мутагенеза получено антагонистическое антитело против с-Met. с-Met — рецептор фактора роста гепатоцитов HGF. Нарушение регуляции с-Met обнаружено при многих злокачественных заболеваниях, оно запускает рост опухоли, инвазию и метастазирование. Полученное в компании BIOCAD гуманизированное анти-c-Met антитело BCD-088 обладает минимальной агонистической активностью, не вызывает аутофосфорилирование рецептора, обладает ADCC и вызывает интернализацию и последующую деградацию c-Met. Сейчас BCD-088 находится в доклинических исследованиях и уже показало эффективность в ряде мышиных моделей онкологических заболеваний.
Материал предоставлен партнёром — Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD
Выбор системы экспрессии
Выше было сказано, что систему экспрессии, то есть тип клеток, в котором будет происходить производство антитела, выбирают на раннем этапе, и ее выбор влияет на то, как должна выглядеть генетическая конструкция и как будут происходить дальнейшее масштабирование и оптимизация экспрессии. Наиболее распространенный во всем мире промышленный вариант системы экспрессии — клетки яичника китайского хомячка CHO (chinese hamster ovary). Клетки СНО дают хорошие выходы белка (как правило, 1–2 г с литра культуры, иногда до 10 г/л), обеспечивают правильное сворачивание и гликозилирование антител, способны к суспензионному росту (то есть в объеме, а не на поверхности) и хорошо адаптируются к изменению условий культивирования, что позволяет масштабировать процесс в различных объемах и использовать их в биореакторах. Другие клеточные линии включают NS0, Sp2/0 (обе — мышиной миеломы), HEK293 (клетки почки человеческого эмбриона) и PER.C6 (получены из человеческих фетальных ретинобластов). Также предпринимаются попытки производства антител в трансгенных растениях и животных, но они пока не дошли до коммерческого использования [25].
Оптимизация вариабельной части антитела — гуманизация
В случае классической гибридомной технологии антиген вводится, как правило, мыши, и в ходе естественного иммунного ответа вырабатываются антитела нужной специфичности. Помимо того, что естественная иммунизация не позволяет контролировать аффинность и селективность антитела, потому что мы не можем проконтролировать представление антигена в иммунной системе и последующий процесс продукции антител, есть еще более важная проблема: при гибридомной технологии мышиное антитело получается чужеродным по отношению к человеку из-за наличия других аминокислотных остатков по сравнению с антителами человека в определенных позициях константной части. Поэтому первое же коммерческое антитело против CD3 — OKT3 — вызывало у многих пациентов антительный ответ.
Такие антитела получили название HAMA — human anti-mouse antibodies, то есть «человеческие противомышиные антитела». Антительный ответ на введенное лекарство сильно снижает его эффективность, потому что приводит к выведению лекарства из организма и делает бессмысленным повторное введение препарата, так как во второй раз антительный ответ гораздо сильнее, и никакой пользы от лекарства точно не будет. Кроме того, антительный ответ может привести к серьезным аллергическим реакциям. Еще одна проблема не полностью человеческих антител — слабое взаимодействие мышиных антител с рецепторами человеческих клеток, которые обеспечивают некоторые из механизмов действия антител и длительность их пребывания в организме. Поэтому перед исследователями встала задача поиска технологий гуманизации антител, то есть приближения их к естественным человеческим аналогам [26].
Химерные антитела
Первым типом антител, приближенных к человеческим, стали химерные (рис. 5). В 1997 году был одобрен ритуксимаб — антитело против белка CD20 на поверхности В-лимфоцитов, предназначенное для лечения В-клеточных лимфом. Для его генерации полученные гибридомным методом вариабельные фрагменты объединили с человеческими константными доменами и таким образом достигли содержания человеческих участков более 70%. Включение ритуксимаба в схемы лечения лимфом произвело революцию, позволив не только увеличить время до прогрессирования заболевания, но и повысить общую выживаемость.
Рисунок 5. Схема получения химерного антитела
Рассмотрим более подробно процесс получения химерного антитела на примере инфликсимаба — препарата против TNF, который, как и рассмотренный выше адалимумаб, применяется для лечения ревматоидного артрита и болезни Крона. Вначале мышь иммунизировали человеческим TNF (hTNF) в сочетании с адъювантом — веществом, усиливающим иммунный ответ, — выделяли спленоциты и сливали их с клетками миеломы. Для отбора клонов клеток, экспрессирующих нужные антитела, использовали радиоиммунный метод с иммобилизованным hTNF. Затем после построения геномных библиотек с использованием фаговых векторов и скрининга путем саузерн-блоттинга [27] выделяли гены, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела. После этого получали плазмиду, содержащую гены мышиных вариабельных участков, объединяли с генами человеческих константных областей (полученных ранее секвенированием генов В-клеток человека) и вводили ее в клетки мышиной миеломы для продукции химерного антитела [28].
Гуманизированные антитела
Хотя химерные антитела оказались более эффективными и менее иммуногенными, чем полностью мышиные, они все же вызывают HACA-ответ — образование human anti-chimeric antibody, то есть человеческих антител против химер. Поэтому с 1980-х годов начали разработку гуманизированных антител, у которых чужеродны человеку только CDR и отдельные позиции FR-регионов вариабельных доменов, а остальные части, включая каркас, почти полностью человеческие (рис. 6). Первым таким антителом в разработке стал алемтузумаб против антигена лимфоцитов CD52. Это лекарство применяется для лечения некоторых гемобластозов и рассеянного склероза [29]. Оно было получено на основе крысиного антитела, чьи CDR перенесли в человеческие домены VH и VL уже существующего человеческого антитела [26].
Рисунок 6. Разница между химерным и гуманизированным антителами. Синим показаны человеческие последовательности, оранжевым — мышиные.
Другой подход применили при разработке антитела даклизумаб против рецептора CD25 на Т-лимфоцитах, которое стало первым гуманизированным антителом на рынке (оно использовалось для лечения рассеянного склероза, но уступило конкурентам и было выведено с рынка). Даклизумаб также был получен включением мышиных CDR в человеческий каркас, но на этот раз человеческие участки антитела подобрали компьютерными методами так, чтобы максимизировать сходство с мышиным антителом, откуда взяты CDR. Кроме того, построили компьютерную модель мышиного антитела, и те аминокислотные остатки каркаса, которые контактировали с CDR, перенесли в каркас человеческого антитела, что позволило улучшить аффинность [26].
Хотя гуманизированные антитела включают повышенное количество человеческих последовательностей по сравнению с химерными, вероятность выработки антител против них остается — они называются HAHA (human anti-human antibody, человеческие анти-человеческие антитела).
HAMA-ответ может быть направлен на все антитело, HACA — против вариабельных областей, а HAHA-ответ еще более фокусный — только против CDR. Некоторые компании предприняли попытки заменить CDR-последовательности, чужеродные для человека, на человеческие. Таким образом удается повысить количество полностью человеческих последовательностей на 17–29% и получать с помощью гибридомной технологии почти полностью человеческие антитела [26].
Полностью человеческие антитела
Существует две группы технологий получения полностью человеческих антител. Одна из них подробно описана выше — это технологии дисплея, в первую очередь, фагового. Вторая — технология использования трансгенных животных, экспрессирующих человеческий репертуар антител. У метода трансгенных животных есть два важных преимущества перед дисплейными: антитела получаются быстрее и, поскольку отбор идет in vivo, а не in vitro, исключено образование антител с плохой растворимостью и другими проблемами в дальнейшей разработке.
Этим методом было получено одно из самых известных сейчас антител ниволумаб против мишени PD-1 на активированных T-лимфоцитах [30], которое вместе с другими антителами класса ингибиторов иммунологических чекпойнтов произвело революцию в лечении метастатических злокачественных заболеваний: меланомы, рака легкого, рака мочевого пузыря, дав впервые в истории надежду на полное выздоровление части пациентов. Ниволумаб был разработан по технологии компании Medarex, которая в 1993 году получила линию мышей, экспрессирующих человеческие IgM, IgG и Igκ и не экспрессирующих мышиные IgM и Igκ. Мыши оказались способными к производству полноценных В-клеток, в которых происходит V(D)J-рекомбинация человеческих трансгенных участков, а после введения антигенов — переключение класса тяжелой цепи и соматический мутагенез. Далее из этих мышей по обычной гибридомной технологии получают человеческие антитела [31].
Так, для получения ниволумаба трансгенных мышей иммунизировали рекомбинантным человеческим белком PD-1-Fc, состоящим из внеклеточного домена PD-1 и Fc-фрагмента IgG. Одновременно мышам ввели клетки яичников китайского хомячка CHO, экспрессирующие на поверхности PD-1. Спленоциты мышей слили с клетками миеломы SP2/0 и отобрали гибридомы, производящие антитела, реактивные против PD-1-Fc, с помощью ELISA. Связывание ниволумаба с CD4+ лимфоцитами определяли методом проточной цитофлуориметрии [32], а кинетику связывания с мишенью — методом плазмонного резонанса [33] (см. раздел «Методы изучения свойств антител»).
Несмотря на то, что у мышей технология Medarex порождает довольно ограниченный репертуар генов, кодирующих человеческие VH и VL, даже его хватает для генерации антител с высокой аффинностью, правда, не во всех случаях. Если антиген, к которому надо получить антитела, высокогомологичен с мышиным аналогом, сделать это не удастся. Здесь на помощь могут прийти трансгенные крысы, куры или дисплейные технологии. Также дисплейные технологии являются единственным выходом, если мишень токсична в концентрациях, необходимых для иммунизации животного [26], например, при разработке нейтрализующих антител против природных токсинов.
Первое оригинальное антитело, созданное в России для иммуноонкологии — BCD-100
В компании BIOCAD с помощью фагового дисплея библиотеки донорских антител человека MeganLib и последующего мутагенеза создано полностью человеческое антагонистическое антитело против рецептора PD-1 — BCD-100 (видео 1). В сравнительных клеточных тестах BCD-100 превзошел препараты коммерческих антител ниволумаб и пембролизумаб. Оптимизация свойств молекулы позволила добиться высокого уровня продукции белка в культуре СНО (более 2 г/л), а также повышенной агрегационной стабильности, что должно обеспечить минимальную иммуногенность препарата и улучшенные фармакокинетические и фармакодинамические свойства. BCD-100 находится на стадии подготовки к клиническим исследованиям III фазы.
Видео 1. Механизм действия BCD-100
Материал предоставлен партнёром — Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD
Оптимизация константной части антитела
До сих пор речь шла в основном о том, как получить правильные последовательности CDR, которые определяют взаимодействие антитела с мишенью, его аффинность и отчасти иммуногенность. Теперь пришла пора поговорить о другой части антитела — Fc-фрагменте, структура которого определяет изотип антитела и такие важные его характеристики, как механизм действия (так называемые эффекторные функции), фармакокинетику и взаимодействие с остальными молекулами организма, помимо мишени.
Выбор подкласса IgG
Более подробно строение антител и особенности различных изотипов описаны во второй статье цикла — «Антитело: лучший способ распознать чужого» [2].
Механизмы действия антител
Клетки иммунной системы экспрессируют на поверхности семейство Fcγ-рецепторов, связывающихся с Fc-фрагментом антител подкласса IgG с разным сродством. Когда антитело связывается со своим антигеном, например, с рецептором на поверхности опухолевой клетки, конформация Fc-фрагмента немного меняется, и сродство к Fcγ-рецептору повышается. Клетка-эффектор с Fcγ-рецептором на поверхности присоединяется к антителу, и каскад событий внутри нее приводит к высвобождению цитотоксических гранул, которые убивают раковую клетку (рис. 7). Этот процесс носит название ADCC (antibody-dependent cytotoxicity — «антителозависимая цитотоксичность»). Наиболее активны в отношении ADCC натуральные киллеры (NK-клетки), несущие на поверхности рецептор FcγRIIIa [35]. Помимо цитотоксических гранул, содержащих гранзим и перфорин, NK-клетки также выбрасывают цитокины IFNγ и TNF, создающие воспалительную среду и привлекающие другие клетки иммунной системы.
Рисунок 7. Различные механизмы действия антител
Показано, что ADCC играет важную роль в механизме действия многих антител против поверхностных мишеней, например, ритуксимаба (анти-CD20), трастузумаба (анти-HER2) и цетуксимаба (анти-EGFR). Наибольшее сродство к Fcγ-рецепторам имеет подкласс IgG1, поэтому, если необходимо, чтобы введение антитела приводило к уничтожению клеток, экспрессирующих мишень на поверхности, используют именно этот подкласс.
Сходный механизм — ADCP (antibody-dependent phagocytosis — антителозависимый фагоцитоз), при котором макрофаг после связывания Fc-фрагмента антитела с Fcγ-рецептором поглощает целиком и раковую клетку, и связавшееся с ней антитело [26].
Другой механизм уничтожения клеток, несущих мишень на поверхности, — CDC (complement-dependent cytotoxicity — комплемент-зависимая цитотоксичность). В этом случае с Fc-фрагментом связывается белок С1q системы комплемента, и запускается каскад событий, приводящий к образованию на поверхности клетки MAC-комплекса. MAC (membrane-associated complex) — это белки, которые формируют в мембране раковой клетки канал, что приводит к ее гибели [26].
Мутации в Fc-фрагменте IgG могут как увеличивать эффекторные функции — ADCC, ADCP и CDC, — так и снижать их. Так, оказалось, что ADCC антитела трастузумаб зависит от того, какой у пациента вариант рецептора FcγRIIIa. У пациентов с определенной мутацией в этом рецепторе антитело оказывается недостаточно эффективным. Введение мутаций в Fc-фрагмент трастузумаба повысило ADCC, что, возможно, позволит создать препарат, подходящий всем пациентам независимо от варианта FcγRIIIa [26].
В некоторых случаях необходимо только заблокировать мишень, например растворимые лиганды, при этом нет необходимости в гибели клеток. Тогда либо используют антитело другого подкласса — IgG2 или IgG4, которые почти не проявляют ADCC-активности, — либо вводят в Fc-фрагмент мутации, снижающие эффекторные функции. Так, для ниволумаба был выбран подкласс IgG4, потому что его мишень PD-1 экспрессируется в нормальных клетках иммунной системы, и было бы нежелательно их уничтожать. Вместо этого ниволумаб, не проявляя ADCC и CDC, блокирует взаимодействие PD-1 на Т-лимфоците с лигандом PD-L1 на поверхности раковой клетки и тем самым не дает раковой клетке снизить активность лимфоцита [26].
Гликозилирование
У молекул IgG в домене CH2 находится сайт N-гликозилирования, то есть присоединения остатков сахаров по атому азота (рис. 8). Модификация остатков сахаров, связанных с антителом, позволяет модулировать некоторые эффекторные функции.
Рисунок 8. Структура гликана IgG. Гликозилирование антител происходит всегда в одном месте — по остатку аспарагина-297.
Гликозилирование абсолютно необходимо для взаимодействия антитела с Fcγ-рецепторами, поэтому удаление остатков сахаров приводит к тому, что CH2-домен изменяет свою конформацию, и антитело теряет все эффекторные свойства.
Модуляция состава сахаров, присоединенных к аспарагину-297, также позволяет увеличивать ADCC. К примеру, удаление остатка фукозы (дефукозилирование) приводит к росту ADCC. Чтобы добиться дефукозилирования, для производства антитела используют клеточную линию, в которой выключен фермент, отвечающий за добавление фукозы — фукозилтрансфераза.
Фармакокинетика
Специфические последовательности, расположенные в районе соединения доменов CH2 и CH3 молекулы IgG, отвечают за ее связывание с рецептором FcRn, которое в значительной мере определяет период полувыведения антитела. Этот удивительный рецептор экспрессируется на многих эндотелиальных и эпителиальных клетках и отвечает за транспорт антител через клеточные барьеры, а также за их возврат в кровоток [36]. Связывание Fc-фрагмента антитела с FcRn в кровотоке при рН 7,4 незначительно, тогда как в кислой среде в эндосомах (pH
Рисунок 9. Взаимодействие антител с рецептором FcRn
Именно поэтому антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG4, обладающие высоким сродством к FcRn, имеют период полувыведения из организма 21 день, а антитела подкласса IgG3 с более низким сродством к нему — всего 5–7,5 дней. Были найдены мутации, усиливающие связывание IgG1 с FcRn, что позволило еще больше продлить период полувыведения.
Иногда, наоборот, нужно ускорить выведение антитела из организма, например, если оно потенциально токсично. В таких случаях вводят мутации, снижающие сродство к FcRn [26].
Методы изучения свойств антител
Плазмонный резонанс
Основной метод изучения кинетики и аффинности связывания антигена с антителом — поверхностный плазмонный резонанс (surface plasmon resonance, SPR). Метод основан на том, что на поверхности металлов при возбуждении источником света под определенным углом возникает плазмон — электромагнитная волна, распространяющаяся вдоль поверхности. Угол, при котором он возникает, зависит от свойств среды в непосредственной близи от поверхности, поэтому адсорбция веществ на поверхности металла приводит к изменению этого угла, и таким образом ее можно измерять (рис. 10) [37].
Рисунок 10. Схема работы прибора на принципе поверхностного плазмонного резонанса. Излучение от источника с длиной волны 760 нм отражается от металлической подложки, на противоположной поверхности которой закреплена одна из двух взаимодействующих молекул. Один из углов отражения является резонансным, и явление поверхностного плазмонного резонанса приводит к снижению интенсивности отраженного под этим углом света. При связывании антитела с конъюгированным лигандом меняется показатель преломления среды вблизи поверхности, резонансный угол отражения изменяется, что регистрируется фотоэлементом.
Наилучшие параметры метода, которые используются в наиболее популярных приборах для плазмонного резонанса Biacore, достигаются при применении в качестве поверхности золотых пластинок толщиной 50 нм [37]. К слою золота ковалентно присоединяется декстрановая матрица, и молекула мишени иммобилизуется в декстране (разветвленном полимере глюкозы).
Использование метода решает следующие основные задачи:
Изучение плазмонного резонанса идеально подходит для скрининга, поскольку он не требует химических модификаций метками для измеряемых биологических молекул в растворе и хорошо автоматизируется.
На измерения также может повлиять скорость переноса антитела из подвижной фазы (буфера) в неподвижную (декстрановую матрицу), поэтому для подтверждения результата рекомендуется пользоваться независимым методом, например, KinExA, в котором измеряется взаимодействие антитела не с иммобилизованным антигеном, а со свободным [38–41].
Вторая проблема заключается в том, что свойства антитела и антигена в растворе и на поверхности отличаются от соответствующих свойств в организме, однако это фундаментальное затруднение характерно для всех аналитических методов in vitro.
Проточная цитофлуориметрия
Другой метод, который рутинно используют при разработке антител — FACS (fluorescence-activated cell-sorting — сортировка клеток с активацией флуоресценции или, по-другому, проточная цитофлуориметрия [32]). В случае антител с помощью FACS можно определить аффинность связывания с поверхностным рецептором клетки прямо на клеточной поверхности, не выделяя рецептор [40]. Это очень полезная особенность, так как поверхностные рецепторы являются мембранными белками, и манипуляции с ними in vitro сопряжены со множеством трудностей: для них требуется создавать особые условия, иначе они не сохраняют свою конформацию и агрегируют.
Для определения аффинности постоянное количество клеток, несущих рецептор, титруется возрастающей концентрацией антитела, при этом каждый раз устанавливается равновесие. Антитела, связавшиеся с клетками, детектируют с помощью других антител, меченых флуоресцентной меткой.
В связи с хорошей автоматизируемостью и высокой производительностью метода он хорошо подходит для скрининга библиотек клонов антител (см. раздел «Дисплейные методы»). Один и тот же клон проверяют на связывание с клетками, экспрессирующими и не экспрессирующими рецептор. Если отношение связывания больше определенного порога, клон отбирают для дальнейшей работы [41].
Методы in silico
После того, как методом дисплея получены фрагменты антител с высокой аффинностью к мишени, важно провести картирование эпитопов, то есть определение того, с каким участком мишени связываются антитела-кандидаты. Кандидаты, связывающиеся с разными участками мишени, лучше подходят для дальнейшего тестирования, так как в случае неудачи одного из кандидатов больше шансов, что другой кандидат будет успешен [42].
Экспериментальное картирование, например, с помощью мутагенеза или рентгено-структурного анализа — долгий и трудоемкий процесс, который не подходит для анализа кандидатов на начальном этапе. Поэтому прибегают к картированию эпитопов in silico — то есть компьютерному расчету эпитопов исходя из аминокислотной последовательности мишени, антиген-связывающего фрагмента антитела и сведений, содержащихся в базах данных эпитопов [43]. Алгоритмы на основе машинного обучения и больших баз данных белковых последовательностей и трехмерных моделей способны предсказывать как линейные, так и конформационные эпитопы. Точность таких предсказаний не стопроцентна, но для грубого отбора фрагментов-кандидатов она вполне достаточна.
Методы in silico применяют и на других стадиях разработки антител. Так, для поиска аминокислотных остатков, предположительно обусловливающих агрегацию антител, используют метод SAP (spatial aggregation propensity — пространственную склонность к агрегации). По этой технологии каждой аминокислоте в антителе присваивается величина SAP в зависимости от ее гидрофобности, степени доступности на поверхности, вкладов гидрофобных взаимодействий с другими аминокислотами в пределах заданного радиуса. Затем для антитела строится цветовая карта, из которой сразу видно, какие области молекулы отвечают за агрегацию. Экспериментально показано, что замена аминокислот в таких участках на более гидрофильные позволяет снизить агрегацию белка и тем самым улучшить его фармакологические свойства [44].
Для разработки стратегии гуманизации антитела также используют методы in silico. При вставке мышиной вариабельной последовательности в человеческий каркас аффинность антитела к антигену может быть снижена. В этом случае применяют «обратное» введение мутаций, отвечающих за более сильное связывание с антигеном. Такие мутации, в частности, можно выбирать путем статистического анализа последовательностей известных комплексов антитело—антиген [45].
Методы молекулярного моделирования с использованием расчета свободной энергии связывания антител с антигенами иногда используют на этапе созревания аффинности для поиска мутаций, обеспечивающих более высокую аффинность [46]. Эти методы предполагают применение энергетических функций, отражающих взаимодействия атомов антигена и антитела между собой. Такие функции могут быть или основаны на физических параметрах взаимодействия атомов, или рассчитаны исходя из статистических данных — как правило, извлеченных из трехмерных структур комплексов антиген—антитело [47]. Однако из-за сложности объекта моделирования и неизбежности многих допущений успехи в этой области пока не так велики, как хотелось бы.
Производство антител
Итак, мы получили генетическую конструкцию, кодирующую антитело с нужными нам свойствами, ввели ее в клетку-продуцент, получили в лаборатории нужные антитела и охарактеризовали их. Что же дальше? Теперь необходимо масштабировать производство и очистку антитела, чтобы получить его в достаточных количествах для последующих исследований, а потом, если все пойдет хорошо, и для продажи. Причем если в случае лабораторных процессов исследователи сами следят за их качеством, то как только лекарственный препарат доходит до стадии исследования токсичности на животных, он попадает под действие законодательства: регуляторные органы (FDA в США, Минздрав в РФ, EMA — Европейское медицинское агентство — в Евросоюзе и т. д.) принимают только такие исследования, которые соответствуют строгому набору правил. В частности, препарат должен быть произведен в соответствии с правилами GMP — Good manufacturing practice («Надлежащей производственной практики»). GMP регламентирует все аспекты производства, начиная от требований к устройству помещений и заканчивая контролем качества продукции. Регулятор имеет право в любой момент проверить соблюдение правил GMP производителем лекарства.
При производстве антител разработчики должны учитывать следующие критерии:
Более подробно об устройстве процесса производства рекомбинантных белков можно прочесть в статье на «Биомолекуле», посвященной Опытному биотехнологическому производству ИБХ [48].
Получение клона-продуцента
Для получения стабильного клона-продуцента антител разработчикам нужно добиться правильного встраивания вектора в геном клетки, модифицировать, если необходимо, аппарат трансляции и посттрансляционных модификаций (про модуляцию гликозилирования см. раздел «Гликозилирование»), добиться высокой жизнеспособности продуцента. В клетках CHO с этой целью снижали экспрессию про-апоптотических факторов и повышали экспрессию анти-апоптотических (например Bcl-2). Трансляцию белка увеличивали, сверхэкспрессируя шапероны, чтобы защитить клетку от апоптоза под воздействием стресса и обеспечить более правильное сворачивание антител [25]. Кроме того, в геном клетки-продуцента вносят модификации, обеспечивающие желаемый профиль гликозилирования.
После создания клеточной линии начинается подбор и оптимизация процесса культивирования, сначала в 96-луночных планшетах, затем в колбах и настольных биореакторах объемом 1–5 л. В результате скрининга сотен и тысяч клонов выбирают клон-продуцент с наилучшими характеристиками и переходят к пилотному культивированию в реакторах объемом 10–25 л, а затем масштабируют процесс до бóльших размеров (рис. 11) [49].
Рисунок 11. Производство антител и других рекомбинантных белков делится на две большие стадии: upstream process (USP), включающий все стадии от размораживания пробирки с клоном-продуцентом до сбора среды культивирования, и downstream process (DSP) — процесс выделения и очистки продукта.
Культивирование
Обычно клетки, производящие антитела, культивируют в биореакторах-ферментёрах объемом от 100 до 25 000 л (рис. 12). Традиционным способом культивирования являются процессы batch и fed-batch. В первом случае все компоненты среды и клон-продуцент загружают в реактор на несколько дней, после чего собирают культуральную среду для выделения белка. Во втором случае в среду периодически добавляют питательные вещества.
Рисунок 12. Внешний вид биореактора
Важнейшим фактором обеспечения высоких выходов белка является культуральная среда. Причем прогресс в этой области продолжается, и если в 1990-х годах выходы составляли 0,1 г/л, в 2007 — до 5 г/л, то сейчас удается достигать 10 и более г/л. Такие успехи стали возможны благодаря переходу от сред, содержащих сыворотку животных к бессывороточным: сначала использовались гидролизаты белков, а сейчас — полностью химические среды с четко определенным составом. Дело в том, что вариабельность состава ухудшает параметры культивирования. Также оказалось плодотворным изменение состава среды в зависимости от стадии культивирования: применяются разные среды в фазе роста и в фазе накопления продукта.
Для повышения продуктивности применяют также тонкую настройку параметров среды с обратной связью: температуры, рН, солевого состава, уровней O2 и CO2, что позволяет добиться снижения концентрации токсичных побочных продуктов (молочной кислоты, аммиака) и более плавного расхода питательных веществ.
В настоящее время наблюдается тенденция к переходу на непрерывные процессы: на так называемое перфузионное культивирование, при котором свежая среда непрерывно добавляется к клеточной культуре, а продукт удаляется из нее. Такой подход лучше автоматизируется, дает продукт более высокого качества и с увеличенными выходами. Также разработчики переходят от стальных биореакторов к одноразовым контейнерам, так как у последних есть ряд преимуществ:
Выделение и очистка антител
Антитела секретируются клетками-продуцентами в окружающую среду, и для получения чистого препарата требуется многоступенчатый процесс отделения антитела от всех ненужных и потенциально опасных примесей (рис. 11). Основными стадиями здесь являются различные виды хроматографии [50], диафильтрация и инактивация вирусов. Одна из особенностей очистки антител по сравнению с другими белками — использование хроматографии с белком А. Это белок клеточной стенки золотистого стафилококка, который сильно и селективно связывается с антителами при нормальном рН и слабо — при пониженном. Благодаря высоким выходам и чистоте получающегося продукта это предпочтительный метод на первом этапе очистки антител.
Важнейшим требованием и на стадии производства, и на стадии очистки антитела является постоянство состава продукта. Поскольку антитело — сложный объект и производится в биологической системе (в клетках), молекулы получаются не одинаковые, а с вариациями (рис. 13). Цель разработки процесса производства и очистки — добиться того, чтобы эти вариации не влияли на фармакологические характеристики продукта, его стабильность, и не слишком менялись от одной партии продукта к другой. Для этого проводится валидация процесса производства — экспериментальное подтверждение того, что процесс обеспечивает получение продукта с надлежащими характеристиками.
Рисунок 13. Профиль гликозилирования определяют методом масс-спектрометрии. На этом спектре видна типичная картина гетерогенности препарата антитела.
На некоторых промежуточных и на финальном этапе состав продукта контролируют аналитическими методами. Обязательно следят за:
Часть этих показателей входит в спецификацию на субстанцию, из которой затем получают лекарственный препарат.
Тем не менее описанные в этой статье технологии уже позволили создать десятки лекарственных препаратов, которые помогают миллионам людей — о чем подробно будет рассказано в следующей статье цикла.
Департамент вычислительной биологии компании BIOCAD — спонсор спецпроекта
BIOCAD — международная биотехнологическая компания, которая создала умную технологическую платформу, объединившую в себе компьютерное моделирование и современные принципы синтеза генов de novo.
В компании реализован полный цикл выпуска лекарственных препаратов: от поиска лекарственной молекулы до массового производства и маркетинговой поддержки.
Компания ведет два масштабных проекта:
Для разработки лекарственных препаратов BIOCAD применяет технологию structure-based drug design, использующую методы компьютерного моделирования. Это позволяет сделать поиск молекул направленным. С помощью математического моделирования отобранная молекула оптимизируется под конкретную мишень, а затем воспроизводится в реальной лаборатории.
В основе большинства разработок компании лежит математическое моделирование. То, что раньше было возможно осуществить исключительно in vitro в стенах лабораторий, по мнению исследователей BIOCAD, сегодня может быть воплощено in silico силой чистого разума.
Здесь собрали одну из лучших команд биоинформатиков в стране, которая занимается научными исследованиями, разрабатывает и внедряет новейшие методы интеллектуального анализа данных. В ее распоряжении один из мощнейших вычислительных кластеров, и если еще 2–3 года назад можно было только мечтать о решении задач направленного дизайна белковых молекул, то сейчас это одно из направлений работ Департамента вычислительной биологии.
Материал предоставлен партнёром — Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD