фибропластика лица что это такое
SPRS-терапия
Создание банка собственных клеток-фибробластов в Институте стволовых клеток.
Клеточное омоложение собственными клетками кожи уже доступно в Эстетик Клуб!
Стоимость процедур
SPRS-терапия – омоложение собственными фибробластами кожи
Наблюдая на лице признаки старения, так хочется повернуть время вспять и снова ощутить нежность кожи, увидеть легкий румянец, убрать морщины и почувствовать ее приятную упругость. Инновационная методика, «технология будущего, которое возможно уже сейчас» – так отзываются врачи всего мира о клеточном омоложении SPRS. Именно эта процедура, в отличие от всех остальных методик, действительно позволяет полностью обновить кожу до состояния молодой, восстановить ее тонус, текстуру и здоровый цвет лица.
SPRS терапия (Service for Personal Regeneration of Skin) – в переводе с английского языка означает «процедура омоложения собственными клетками кожи». Комплекс лечебно-диагностических мероприятий, которые позволяют реструктуризировать кожу путем выращивания собственных фибробластов. Клеточное омоложение SPRS – это единственная клеточная технология в России, одобренная Министерством здравоохранения РФ. Эстетик Клуб аккредитован Институтом стволовых клеток человека для выполнения SPRS терапии в Санкт-Петербурге.
Процесс старения кожи обусловлен катастрофическим снижением количества фибробластов. Фибробласты – клетки, которые вырабатывают необходимые для молодости нашей кожи компоненты соединительной ткани: коллаген, эластин, гиалуроновую кислоту. Альтернативные методики улучшают условия, в которых находятся фибробласты, активизируют работу этих клеток, но, в отличие от SPRS терапии не добавляют их количество. Беспрецедентный эффект SPRS терапии – это полная реструктуризация кожи и ее обновление на биологическом уровне, которое приводит к улучшению ее рельефа, текстуры и цвета.
Как выполняется процедура
Методика SPRS терапии состоит из нескольких этапов:
Суспензия для SPRS доставляется строго к определенному времени проведения процедуры, а сами инъекции выполняются тончайшими иглами однократно. При необходимости и по желанию процедуру можно повторить через 1 год.
Показания и противопоказания
Естественные возрастные изменения, сниженный ответ на альтернативные эстетические методики, необходимость быстрого восстановления после агрессивных косметологических процедур (пилинги, шлифовки) или после пластических операций – все это показания для SPRS терапии. С помощью клеточного омоложения можно существенно замедлить процессы старения кожи, а также создать и надолго сохранить запас собственного «эликсира молодости», эффективность которого несравнима с другими процедурами.
Среди противопоказаний – заболевания крови, онкологические и инфекционные болезни. Аллергические реакции и другие побочные эффекты исключены, так как используются аутологичные клетки. Восстановительный период – отсутствует.
SPRS терапия – абсолютно безопасная технология, которая прошла множество клинических исследований. Комбинированное лечение кожи другими косметологическими процедурами в сочетании с SPRS позволяет достичь еще более выраженных результатов, в сравнении с воздействием от тех же процедур на неподготовленную кожу.
Эффект
Процесс старения кожи связан с катастрофическим снижением количества фибробластов. На биологическом уровне SPRS терапия позволяет восполнить дефицит фибробластов и создать все условия для стимуляции естественных процессов обновления кожи путем добавления собственных новых клеток.
После проведенной SPRS терапии вы ощущаете повышение плотности кожи, ее упругости, эластичности, подтягивается контур лица. Вы видите, как уменьшаются морщины, а цвет лица отличает здоровый румянец, появляется эффект «детской» кожи, мягкость и сияние. Коррекция причин, а не последствий старения – уникальное преимущество SPRS, которое позволяет получить впечатляющий результат.
Первые видимые изменения появляются спустя месяц после процедуры. Устойчивый эффект сохраняется до 24 месяцев и все это время «новые» аутологичные клетки обогащают кожу питательными активными веществами, разглаживая морщины, поддерживая нормальный уровень увлажненности кожи и сохраняя молодость. Поддерживающую процедуру можно повторить через год, однако, как правило, в зависимости от образа жизни пациента, такая необходимость возникает не ранее чем через 2-3 года.
Омоложение фибробластами (SPRS-терапия)
SPRS терапия – это инъекционная процедура, направленная на омоложение кожи собственными фибробластами. Методика разработана на базе Института стволовых клеток человека, который является лидером в области клеточных технологий РФ и единственной организацией, получившей разрешение Росздравнадзора на применение этой высокоэффективной технологии для коррекции возрастных и рубцовых изменений кожи.
Процедура начинается с забора небольшого участка кожи, диаметром 4 мм. Кожу берут в области за ухом пациента. Поврежденный участок кожи заклеивают пластырем, и она заживает самостоятельно через несколько дней. Забранный материал помещают в специальную емкость и отправляют в лабораторию, в которой с помощью инновационных методов выделяют фибробласты – клетки кожи, отвечающие за выработку коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и другие важные для кожи вещества. Современные методы позволяют оценить регенеративный потенциал клеток и, следовательно, способность кожи к восстановлению и обновлению. Фибробласты культивируют – отбирают и стимулируют только молодые и активные клетки. Слабые клетки исчезают. Фибробласты размножают до необходимого количества (десятки миллионов), помещают в специальную емкость для транспортировки и отправляют обратно в клинику.
SPRS-программа включает в себя назначение по количеству курсов терапии, срокам их проведения, а также использованию других косметологических методик в отношении их воздействия на кожу для коррекции эстетических недостатков и их профилактики, без каких либо побочных эффектов.
Что такое SPRS препарат?
SPRS-препарат, полученный в лаборатории- это суспезия, в которой содержатся миллионы фибробластов кожи пациента в физиологическом растворе для инъекций. Препарат при строго контролируемых условиях доставляют в клинику к назначенному пациентом времени.
Часть фибробластов помещают в криобанк, где в жидком азоте они могут хранится неограниченное время. Эти клетки могут в дальнейшем использоваться в течении всей жизни человека.
Как проходит SPRS-терапия?
Один курс терапии подразумевает 2 процедуры, промежуток между которыми составляет от 4-х до 6 недель.
Процедура начинается с нанесения на кожу обезболивающего крема, который остается на коже на 60 минут. SPRS-препарат с собственными фибробластами пациента вводится в кожу тонкими иглами. После процедуры могут появиться небольшие синяки и отечность в месте укола, которые проходят через несколько дней. Фибробласты легко усваиваются и запускают процесс регенерации, обновления и омоложения кожи, стимулируют выработку коллагена, эластина и замедляют процесс старения.
Эффект от процедуры:
Фибробласты – инъекции молодости для лица и тела
Инъекции фибробластов, за которыми раньше ездили в Швейцарию, наконец-то получили официальное одобрение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения.
Ученые называют эти клетки «мини-фабриками»: именно они производят коллаген, эластин и гиалуроновую кислоту – все те компоненты, ради стимуляции воспроизводства которых разрабатываются самые прогрессивные косметологические препараты и процедуры.
С возрастом фибробласты работают все медленнее, из-за этого кожа становится тоньше и теряет упругость. А с помощью инъекций в кожу попадают новые «рабочие руки». Все, что для этого требуется – взять образец ваших фибробластов и размножить их в лабораторных условиях.
↑ Инъекции фибробластов в России
Первой эту технологию запатентовала американская компания Fibrocell Science еще в 1994 году. Ее стали применять вначале в хирургии – для лечения ожогов и долго не заживающих ран, затем в стоматологии – для борьбы с пародонтитом.
В отличие от западных лабораторий, предлагающих пациентам стандартную программу введения фибробластов, Зорины составляют индивидуальный «паспорт кожи»: прогнозируют, как сильно будет меняться ее структура в дальнейшем, и определяют, сколько клеток и с какой периодичностью нужно будет вводить. С лабораторией Зориных договор уже подписали ведущие московские клиники – в том числе «Клазко» и «Леге Артис».
↑ Эффект фибробластов
 |
Где проводят инъекции фибробластов?
Список сертифицированных клиник:
«Преимущества этой терапии очевидны, – говорит Вадим Зорин. – Все происходит максимально естественно: организм сам запускает процессы физиологического омоложения и улучшения структуры кожи. За все время использования этих инъекций ни у нас, ни в мире не выявлено ни одного осложнения. Фибробласты – не чужеродные, а ваши собственные клетки, поэтому отторжение, аллергические реакции и прочие неприятности просто исключены»
«Мы отслеживали состояние кожи тридцати пациентов в течение двух лет, – рассказывает заместитель главного врача «Леге Артис», специалисты которой принимали участие в клинических испытаниях инъекций, кандидат наук Светлана Донецкая. – Оценивали эластичность, увлажненность, цвет, уровень пигментации, сокращение морщин – и были впечатлены результатами. Я считаю, что сегодня это лучший безоперационный способ омоложения».
Сама Донецкая сделала себе инъекции самостоятельно два года назад: «По травматичности их можно сравнить с любыми другими уколами красоты, у меня даже не было синяков. Эффект проявился примерно через месяц, когда накопилась достаточная масса нового синтезированного коллагена. Ощущения незабываемые: встаешь утром и понимаешь, что у тебя другое лицо! И так каждый день в течение полутора лет. Потом можно вколоть еще».
Правда, врачи предупреждают: ждать мощного разглаживающего эффекта не стоит, и лучших результатов добьются те, у кого нет проблем с провисанием кожи. Именно поэтому не исключено, что найдутся и разочарованные фибробластами пациенты. От инъекций многие ждут лифтинга, а здесь речь о качестве кожи: глубокие морщины клетки не разгладят.
В медицинском центре The Platinental через SPRS-терапию (Service for Personall Regeneration of Skin – так официально называется разработка Зориных) уже прошли около тридцати человек. «По большей части это мужчины, бизнесмены и политики, не готовые, чтобы над их пластическими операциями смеялись, как в Италии над Берлускони, – рассказывает руководитель центра, пластический хирург Андрей Искорнев. – Заморозить свои клетки лучше в более юном возрасте, когда они наиболее активны».
↑ Как проходит процедура
Под местной анестезией доктор берет у вас за ухом кусочек кожи размером около четырех миллиметров. Крошечную ранку заклеивают пластырем на ближайшие три дня. Образец тут же забирает курьер и доставляет в лабораторию. Спустя шесть недель в клинику привозят «растиражированные» фибробласты, которыми обкалывают лицо, включая область вокруг глаз, руки, шею и декольте.
Кроме того, полученные от пациента клетки будут храниться в криобанке Института стволовых клеток человека при температуре минус сто девяносто шесть градусов хоть всю жизнь: их будут размножать по мере необходимости. Рекомендованный график инъекций – раз в год.
Результат проявляется как постепенное улучшение состояния кожи, которое происходит непрерывно на протяжении достаточно продолжительного (несколько месяцев) времени.
↑ Сколько стоят фибробласты? Цены на инъекции
Стоимость процедуры в московских клиниках не отличается от западных: от 250 до 300 тысяч рублей. Немало – цена на инъекции фибробластов получается в полтора раза дороже круговой подтяжки лица. Но если учесть экономию на сложных пилингах и шлифовках, не говоря уже о Ботоксе и филлерах, то сумма и в десять тысяч долларов уже не выглядит такой угрожающей.
Блефаропластика верхних и нижних век
Блефаропластика — хирургическая операция, корректирующая форму век и разрез глаз. Хирург удаляет участки кожи, жировую прослойку нижнего и верхнего века, обеспечивая эффект подтяжки.
Кожа в этой зоне стареет первой, из-за потери эластичности веко опускается. Дистрофическим изменениям после 30 лет подвергается и подкожно-жировая клетчатка — она разрастается и начинает подвисать. Взгляд становится усталым, невыразительным. 
Поэтому за блефаропластикой чаще всего обращаются женщины и мужчины 40–45 лет, желающие устранить эти косметические дефекты. За счет поднятия кожи взгляд получается более открытым, лицо кажется моложе.
Эстетические показания к блефаропластике
Медицинские показания к блефаропластике
Виды блефаропластики
Верхняя, или анкерная, блефаропластика
Нижняя, или сублициарная, блефаропластика
Круговая блефаропластика
Трансконъюнктивальная блефаропластика
Хирург может делать разрез над верхними ресницами, с наружной стороны века, или минипроколы на слизистой оболочке, с внутренней стороны. В последнем случае технология называется трансконъюнктивальной. Такой тип блефаропластики позволяет добиться высокого эстетического эффекта, поскольку швы накладывать вообще не нужно, а значит, не будет никаких шрамов.
Иногда одной блефаропластики на веки недостаточно для коррекции дефекта. Ее сочетают с хирургической подтяжкой лица в определенных зонах (лобная, надбровная, подглазничная, скуловая или щечная области).
Обследование перед блефаропластикой
Анестезия
Обычно блефаропластика на веки проводится под местной анестезией. Если пациент чрезмерно волнителен или установлена множественная аллергия на местные анестетики (новокаин, лидокаин), рассматривается эндотрахеальный наркоз — то есть общий.
Перед общим наркозом пациента осматривает анестезиолог. Он оценивает операционные риски и определяет правильную схему анестезиологического пособия.
Подготовка к операции
Блефаропластика на веки под местной анестезией не требует особой подготовки. В день операции нужно прийти в клинику на голодный желудок, смыть с лица всю косметику.
Эндотрахеальный наркоз подразумевает тщательную подготовку — пациента кладут в стационар за день до операции. В эти сутки рацион должен быть полуголодным, от ужина придется отказаться. Кишечник очищают с помощью клизмы.
В день вмешательства запрещается есть и пить.
Как проходит операция
Хирург трижды обработает веки антисептическим раствором, затем отграничит операционное поле от окружающих тканей стерильным материалом.
Инъекции местного анестетика — единственный болезненный момент во время хирургического вмешательства. Пока вводится лекарство, вы будете ощущать боль и распирание мягких тканей века. Неприятные симптомы сменятся полной нечувствительностью уже через 1–3 минуты.
Верхняя блефаропластика
Хирург разметит кожу верхних век и обозначит линии разреза. При блефаропластике верхнего века ткань разрезают на 7–9 мм от его края и бережно иссекают избыточную кожу.
Капиллярное кровотечение останавливают электрокоагулятором — прибором для прижигания поврежденных сосудов. Грамотный хирург приступает к ушиванию раны только после достаточной остановки кровотечения. Швы на верхнее веко накладываются тонкой атравматичной иглой строго по линии разреза. 
Нижняя блефаропластика
При блефаропластике нижних век разрез делается на расстоянии 2–3 мм от ресничного края.
Кожу нижнего века вместе с круговой мышцей глаза аккуратно сдвигают вниз на несколько миллиметров, открывая доступ к грыжевым мешкам. Они иссекаются, после кожу нижних век возвращают в исходное положение.
Избыточные кожные складки хирург иссекает рядом с первичным разрезом единым линейным лоскутом.
Последний этап нижней блефаропластики — послойное ушивание раны нижних век. Шов накладывают внутрикожно, чтобы избежать рубцевания и плохого сопоставления краев раны. Наши хирурги накладывают косметические швы по современным методикам и добиваются высокой эстетики. 
Реабилитация
Первые часы после операции
Первая неделя после операции
Швы с раны снимают на 7–9 день периода реабилитации.
Отсроченный период
Возможные осложнения
Что не должно вас пугать
Что должно насторожить
Ошибками хирургов считаются только некоторые из осложнений блефаропластики
Результат и прогноз
О промежуточном эффекте от блефаропластики можно судить спустя 2–3 недели после операции. Итоговый результат оценивается через 3–6 месяцев после и сохраняется 8–12 лет.
Но кожа продолжает утрачивать эластические свойства, поэтому иногда может потребоваться повторная блефаропластика век раньше срока. В старших возрастных группах ее часто сочетают с хирургической подтяжкой лица.
Хороший итоговый эффект от блефаропластики — результат конструктивного диалога между врачом и пациентом, мастерства доктора и правильного реабилитационного периода.
Пластика век в «Академии VIP» — это безопасно
В нашем медицинском центре работают пластические хирурги и хирурги-офтальмологи, которые провели уже более 5000 блефаропластик. учитывают физиологию всего придаточного аппарата глаз: мышц, кожи и хрящевой ткани века, подкожной клетчатки и конъюнктивы. Доктор точно определяет объем вмешательства, чтобы прийти к хорошему результату и не нарушить функцию зрительного органа.
У нас есть лицензия Росздравнадзора на оказание услуг пластической хирургии.
Записывайтесь на консультацию к хирургу по телефону или через сайт. На дополнительные вопросы ответит менеджер в онлайн-чате.
Методы функциональной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний
Лапароскопия яичника в Нижнем Новгороде
Пред — и послеоперационное ведение пациента врачом дерматокосметологом
Заказать обратный звонок
Оставьте ваши контактный данные и мы перезвоним Вам в ближайщее время
Записаться на приём
Выберете нужную специализацию врача, оставьте Ваши контактные данные, и мы запишем вас на приём
© 2020 «Академия VIP» Mногопрофильная клиника в Нижнем Новгороде
Данный сайт не является публичной офертой. Более подробную информацию необходимо уточнять по телефонам клиники и на очном приеме.
Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования
С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»
И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»
Введение
Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.
Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).
В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.
Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).
Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.
Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.
Материалы и методы
Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.
Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.
Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).
Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).
Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.
Результаты и обсуждение
В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).
Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже
По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).
Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.
Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.
Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.
В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.
Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).
Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.
Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.
На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.
Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия
Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).
Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).
Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Заключение
Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.