Днк генотипирование что это

ВПЧ генотипирование: что это

Генотипирование ВПЧ проводится в случае выявления у человека признаков папилломавирусной инфекции.

Это важная диагностическая процедура, позволяющая определить, насколько опасным является вирус, поселившийся в вашем организме.

Зачем нужно ВПЧ-генотипирование?

ВПЧ является гетерогенным вирусом.

Это означает, что существует множество его форм.

Фактически, это целое семейство вирусов, различных по уровню патогенности.

При заражении разными типами ВПЧ в разной степени увеличивается риск рака, возникают разные симптомы.

Около 40 типов ВПЧ передаются половым путем.

Четырнадцать из них являются вирусами высокого онкогенного риска.

Таким образом, генотипирование используется для того, чтобы узнать: какой тип вируса персистирует у пациента.

Это важно для оценки онкогенного риска.

Ведут пациентов с разными типами ВПЧ совершенно по-разному.

Если с низкоонкогенными вирусами человеку можно удалить бородавки и отправить домой, то обнаружение высокоонкогенных типов требует динамического наблюдения.

Возрастает роль медикаментозной терапии.

Человеку важно избавиться от носительства вируса как можно скорее, чтобы предотвратить предраковые процессы и онкологические заболевания.

У всех ли ВПЧ вызывают рак?

Конечно же, далеко не у каждого человека вирусы вызывают рак.

Даже те, которые имеют высокий онкогенный риск.

В 90% случаев человек заражается, и самостоятельно излечивается в течение 1-2 лет.

Часто у него вообще нет никаких симптомов.

В иных случаях появляются кондиломы или изменения эпителия.

Но патологические очаги исчезают после элиминации вируса.

Тем не менее, в 10% случаев формируется хроническая персистирующая инфекция.

Именно она представляет наибольшую угрозу.

Чаще всего ВПЧ вызывает цервикальный рак у женщин.

Другие виды злокачественных опухолей, в том числе среди мужчин, являются большой редкостью.

К ним относятся новообразования:

Наблюдение требуется в первую очередь за женщинами.

У них вирус вызывает цервикальный рак, а это самая распространенная причина смерти от онкологических причин среди пациенток репродуктивного возраста.

Чаще в этот период встречается только рак груди.

Но от него умирают реже.

Коварство заболевания состоит в том, что выявляется оно поздно, а эффективность лечения низкая уже со 2 стадии.

Тем не менее, цервикальный рак распространен только в странах с низким уровнем медицины.

Это полностью контролируемое заболевание.

Рак не развивается на ровном месте.

Существует множество способов предотвратить его.

Для этого можно вовремя выявить ВПЧ, провести генотипирование, установить наблюдение в случае обнаружения вируса высокого онкогенного риска.

Уже на этом этапе медикаментозное лечение часто позволяет избавиться от инфекции и предотвратить предраковые процессы.

Если же выявлены предраковые заболевания, то они могут быть излечены.

И на всё это у женщины есть даже не годы – десятки лет.

Но если она никогда не ходит к гинекологу и не сдает анализы, то цервикальный рак появляется и развивается.

Хотя происходит это медленно, выявить болезнь вовремя шансов нет.

Потому что симптомы отсутствуют вплоть до того момента, когда патология становится неизлечимой.

ВПЧ генотипирование: что дает этот анализ

Это процесс определения типа вируса.

Он основан на определение участка ДНК, то есть, генотипа возбудителя.

Цели исследования:

В итоге проведения теста врач получает такую информацию:

ВПЧ ВКР генотипирование

ВКР расшифровывается как высокий канцерогенный риск.

Таким образом, это исследование отличается тем, что определяются только высокоонкогенные вирусы.

К примеру, вы не получите заключение: обнаружен 6, 11 или другой тип с низкой онкогенностью.

На них тестирование может не проводиться.

Ситуации, когда требуется типирование именно на вирусы ВКР:

То есть, анализ делают, когда риск онкопатологии у конкретного пациента оценивается как высокий.

При этом может быть неважным, присутствуют ли другие вирусы из числа тех, которые почти никогда не вызывают рак.

ВПЧ генотипирование: количественный анализ

Врачу мало знать только тип вируса.

Необходима также информация о его количестве.

Единицей измерения служит количество ДНК в 100 тысячах эпителиальных клеток.

Их должно быть меньше 10 в 5 степени.

Если этот порог достигнут или превышен, такая концентрация вируса считается клинически значимой.

Онкогенные вирусы в таком количестве провоцируют интраэпителиальную неоплазию.

А затем на её фоне развивается рак.

Зачем врачу знать количество вируса:

Анализ проводят на 10-14 высокоонкогенных типов.

Для определения количественных показателей проводится ПЦР в реальном времени.

Она дает возможность дифференцировать клинически значимую концентрацию вируса от разрешающихся или транзиторных форм инфекции.

Кому рекомендовано генотипирование ВПЧ?

В нашей стране типирование назначается не с профилактической целью, как на Западе, а по медицинским показаниям.

Многие женщины не проходят скрининг.

Поэтому частота цервикального рака и смертность от него в стране остается высокой.

Обычно женщины приходят к врачу, если у них появились бородавки на гениталиях, либо были получены патологические результаты цитологического исследования цервикального мазка.

Но большинство международных организаций рекомендуют делать анализ на ВПЧ даже без каких-либо симптомов или предварительных исследований.

То есть, проводить его всем подряд поголовно.

Согласно рекомендациям FIGO исследование на ВПЧ проводят 1 раз в 5 лет до возраста 65 лет.

ВОЗ рекомендует делать анализ минимум 1 раз всем женщинам, пребывающим в возрасте 30-49 лет.

Необходимость обследования на ВПЧ предусмотрена и российским приказом Минздрава 572н от 1 ноября 2012.

Непосредственно генотипирование (определение точного типа ВПЧ) не является обязательным.

Но по возможности рекомендуется проводить типирование хотя бы на 16 и 18 типы как на самые опасные среди всех существующих.

Допускается также применение альтернативных исследований.

Широко используется Digene-тест.

Он основан на гибридизации участков ДНК с РНК зондами.

В дальнейшем они улавливаются антителами с флуоресцентной меткой.

При позитивном результаты выдаются количественные показатели.

Существуют также тесты, основывающиеся на обнаружении РНК ВПЧ.

В частности, тест Aptima способен обнаружить 14 высокоонкогенных типов с частичным генотипированием.

Что делать, если выявлены опасные типы ВПЧ?

Риск обнаружения опасных типов ВПЧ у отдельно взятого человека невысокий.

У большинства людей никакие разновидности этого вируса не выявляются вообще.

Если же пациент инфицирован, то с высокой вероятностью это неопасный тип ВПЧ.

Низкоонкогенные разновидности встречаются гораздо чаще.

Если же вам не повезло, и у вас обнаружили высокоонкогенный ВПЧ, нужно смотреть на его количество.

В случае, когда оно небольшое, лечение не требуется.

Скорее всего, ваш организм уже начал избавляться от вируса, и вскоре он перестанет определяться.

Хуже, если концентрация его высокая.

В таком случае необходимо следующее:

Чаще всего это исследование проводят не после генотипирования ВПЧ, а одновременно с этим тестом.

По результатам этих двух анализов может быть принято решение о необходимости кольпоскопии.

Она нужна для выявления участков измененного эпителия (предраковых процессов).

В свою очередь результаты кольпоскопии (осмотра цервикса) могут потребовать проведения биопсии.

Это процедура, при которой берут фрагмент ткани и отправляют на гистологическое исследование.

По его результатам может быть диагностирована как злокачественная опухоль, так и предраковый процесс 1-3 стадии.

1 стадия обратима, тогда как на 2-3 требуется «прижигание», чтобы предотвратить рак.

Но развиваются предраковые процессы очень медленно.

Если вовремя провести противовирусное лечение, то вирус исчезает из организма, и эпителий шейки матки восстанавливается.

Пациентов обязательно наблюдают.

Они сдают анализы раз в полгода, чтобы оценить, увеличивается или уменьшается концентрация вируса.

Для его элиминации используют противовирусные и иммуномодулирующие препараты.

Можно ли делать ВПЧ без генотипирования?

Конечно же, делать такой анализ можно.

Он тоже достаточно информативен.

Генотипирование ВПЧ цены имеет более высокие, и такие затраты не всегда нужны.

В любом случае в результате проведения теста будет определен тип или нет, врач узнает, присутствует ли в организме папилломавирус ВКР.

Если он есть, и если присутствует в большой концентрации, в любом случае пациенту необходимо:

И это нужно, вне зависимости от конкретной разновидности обнаруженного вируса.

Где сдать анализы на типирование ВПЧ?

Сдавать анализы на ВПЧ нужно всем без исключения женщинам.

И не важно, есть ли у вас основания полагать, что вы заражены.

ВПЧ – вирус с огромной распространенности в популяции.

Это причина подавляющего большинства случаев цервикального рака.

А тот, в свою очередь, по распространенности у женщин в развивающихся странах уступает только раку груди.

Если вы хотите предотвратить цервикальный рак, приходите в нашу клинику и пройдите скрининг.

У нас проводятся все необходимые исследования:

Если анализы будут хорошими, вы приобретете эмоциональное спокойствие и уверенность в том, что опасная болезнь обойдет вас стороной.

Если же обнаружится ВПЧ высокого риска, то сможете вовремя пройти лечение и предотвратить цервикальный рак.

Для сдачи и интерпретации анализа на генотипирование ВПЧ обращайтесь к автору этой статьи – дерматовенерологу в Москве с многолетним опытом работы.

Источник

Молекулярно-биологические методы диагностики ВПЧ-инфекции

Молекулярно-биологические методы предоставляют информацию о развитии ВПЧ-инфекции, но не позволяют судить о наличии заболевания, поскольку факт инфицирования ВПЧ не всегда сопряжен с заболеванием. Два основных метода диагностики ДНК ВПЧ — полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени и метод гибридного захвата (Digine-тест). Оба метода практически не отличаются по чувствительности и специфичности, однако, сертифицирован и одобрен FDA только Digene-тест.

Технология Digene-теста основана на гибридном захвате и заключается в уникальном способе связывания вирусной ДНК с РНК-зондом, захвате полученного гибрида моноклональными антителами и хемилюминисцентной детекции образуемых комплексов.

По сути это качественный тест, который применяется для профилактического скрининга для ранней диагностики патологии шейки матки. Тест идентифицует 13 генотипов высокого (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) и 5 генотипов низкого риска (6, 11, 42, 43, 44).

Тест одобрен Федеральной службой РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФСНСЗСР). Digene-тест выявляет клинически значимый уровень инфицирования вирусом папилломы человека, который приводит к развитию неоплазии шейки матки. Положительный результат теста выдается в единицах Digine. Отрицательный тест практически исключает CIN II и CIN III.

Обнаружение ДНК ВПЧ в качественном формате

ДНК ВПЧ длительно сохраняется в образцах тканей, поэтому ее легко можно идентифицировать. Для определения достаточно минимального количества исследуемого образца. «Качественное» определение ДНК ВПЧ имеет спорную клиническую значимость, поскольку указывает только на факт наличия вируса, не позволяя сделать прогноз относительно течения инфекции. В большинстве случаев инфекция элиминируется самостоятельно.

Количественное определение вируса ВПЧ

Количественный анализ ДНК ВПЧ наиболее чувствителен на ранних этапах папилломавирусной инфекции, когда отсутствуют другие признаки инфицирования. Например, цитологические, клинические. Метод количественного определения используется в качестве скрининга, особенно в рамках национальных программ контроля рака шейки матки, а также для оценки эффективности терапии.

Количественные ПЦР-методы направлены на максимальную чувствительность выявления вирусной ДНК, однако, не всегда существуют прямые клинические корреляции.

Одним из критериев клинически значимой инфекции, которая с высокой степенью вероятности способна развиться в неоплазию, рассматривается вирусная нагрузка. Вирусная нагрузка 3 lg на 105 клеток является клинически малозначимой, поскольку сопровождается минимальным риском дисплазии и почти в 100% случаев заканчивается спонтанной регрессией. Вирусная нагрузка больше 5 lg на 105 клеток считается повышенной и сопряжена с высоким риском развития дисплазии. Снижение вирусной нагрузки на 1 lg за 6 месяцев говорит о транзиторной инфекции.

Прогностическая ценность вирусной нагрузки на сегодняшний день однозначно не определена.

Генотипирование вируса методом ПЦР позволяет определить тип вируса ВПЧ и его онкогенность. Этот метод подходит для выявления персистенции ВПЧ и позволяет отличить случаи реинфекции. О реинфицировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции — сохранение генотипа вируса через год после первого тестирования.

При инфицировании несколькими генотипами ВПЧ одновременно, прогноз течения заболевания менее благоприятный, а риск персистенции и риск развития РШМ по сравнению с инфицированием одним типом более высокий.

Выявление ВПЧ высокого риска свидетельствует о наличие папилломавирусной инфекции. ВПЧ высококанцерогенного риска имеют различный онкогенный потенциал. На долю самых опасных, 16 и 18, приходится около 70% всех случаев цервикального рака. Генотипирование на ВПЧ 16 и 18 позволяет выделить группу женщин, которые имеют повышенный риск развития цервикального рака.

Рекомендации ВОЗ по профилактике рака шейки матки

Источник

Инфекция, вызываемая вирусом папилломы человека

ВПЧ – группа распространенных и генетически разнообразных вирусов, инфицирующих и поражающих эпителий кожных покровов (кожные типы ВПЧ) и слизистых оболочек ротовой полости и аногенитальной области (генитальные типы ВПЧ). Генитальные типы ВПЧ передаются преимущественно половым путем и через родовые пути от матери ребенку. Основными клиническими формами папилломавирусной инфекции гениталий являются остроконечные кондиломы, а также злокачественные формы изменения эпителиальных клеток, приводящие к раку шейки матки.

Исход инфекции зависит от типа вируса. Типы ВПЧ низкого канцерогенного риска (НКР, низкоонкогенные) связаны с остроконечными кондиломами и дисплазиями легкой степени. Типы ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР, высокоонкогенные) – 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 – наряду с остроконечными кондиломами и дисплазиями легкой степени, также индуцируют злокачественную трансформацию эпителия, приводящую к инвазивному раку.

Дифференциальная диагностика. Поражения шейки матки, влагалища, вульвы, пениса, заднего прохода непапилломавирусной этиологии; в случае остроконечных кондилом – с проявлениями, связанными с вирусом простого герпеса, а также с истинными папилломами.

Лабораторная диагностика папилломавирусной инфекции включает выявление и количественное определение ДНК ВПЧ ВКР, генотипирование ВПЧ ВКР, выявление ДНК ВПЧ НКР.

Материал для исследования

Выявление и определение концентрации вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска

Показания к обследованию

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Для выявления ДНК ВПЧ ВКР используют МАНК (ПЦР, NASBA, TMA и др.) и методы амплификации сигнала (гибридный захват). Культивировать вирус не удается.

Гибридный захват является первым и наиболее охарактеризованным методом выявления ДНК ВПЧ. Применение метода позволяет определять концентрацию вируса в условных единицах оптической плотности, линейный диапазон небольшой (3–4 порядка). Образцы, в которых присутствует вирус в концентрации ниже порога клинической значимости, учитываются как отрицательные. Граница клинической значимости определяется путем тестирования эталонного образца (концентрация ДНК ВПЧ 1 пг/мл). Все сигналы, значения которых ниже эталонного, считаются отрицательными. Более современными, быстрыми и удобными для использования являются методы на основе АНК. МАНК, работающие в неколичественном формате, выявляют либо ДНК вируса (ПЦР, HDA и др.), либо мРНК транскрипты онкогенов E6 и E7 ВПЧ (NASBA, TMA). Для выявления только клинически значимых концентраций (по разным методикам учета – более 1 пг/мл или 1000 копий ДНК вируса на 100000 клеток человека) используют методики с чувствительностью, при которой образцы с низкой концентрацией учитываются как отрицательные. Наиболее целесообразно использовать ПЦР в реальном времени, которая позволяет точно определить концентрацию ДНК вируса. На основе полученных данных проводится не только оценка концентрации вируса, но, что важно, проводится градация результата по клинической значимости полученной концентрации на:

Различные наборы реагентов могут отличаться спектром выявляемых генотипов. К группе ВПЧ ВКР относятся 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 генотипы. Наиболее канцерогенными считаются 16 и 18 типы, наименее – 51, 56, 68. Для РФ и стран СНГ клинический смысл исследования сохраняется только при определении как минимум 10 генотипов из перечисленных выше. Выявление в смеси генотипов низкого или неустановленного риска существенно снижает специфичность выделения группы риска онкологической патологии и не может быть оправдано.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Для проведения скринингового обследования на наличие предрака и рака шейки матки предпочтительным является использование мазков/соскобов эпителия цервикального канала и зоны трансформации, выполненных цервикальными цитологическими щеточками. Допускается использование для этих целей мазков из влагалища. Для скрининга рака шейки матки все тесты, вне зависимости от выбранной технологии, должны иметь сбалансированные аналитические и диагностические характеристики, удовлетворяющие следующим условиям – не менее 98% чувствительность по отношению к CIN2+ и не менее 90% специфичность относительно широко валидированного в скрининге теста (например, Hybrid Capture II). Для достижения оптимума аналитической чувствительности избирают подход отсечения образцов с концентрацией ДНК ВПЧ ниже порога клинической значимости. Для этого либо проводят искусственное снижение аналитической чувствительности, либо выбирают в качестве референтного контрольный образец с требуемой пороговой концентрацией. Предпочтительным является измерение концентрации ДНК ВПЧ методом ПЦР в реальном времени.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Обнаружение ДНК ВПЧ в любой концентрации свидетельствует о наличии возбудителя, однако при интерпретации результатов тестирования следует учитывать, что более 80% инфицированных спонтанно излечиваются в течение 12–24 мес. Опасность представляет персистентная форма инфекции (сохраняющаяся более 12–24 мес.). Однократный положительный результат надежно указывает на принадлежность к группе риска развития рака шейки матки в случае, если исследование проводится в группе женщин старше 30 лет или вступивших в половую жизнь более 6–7 лет назад. Особая настороженность должна быть проявлена в отношении пациенток, у которых подтверждается персистенция вируса при повторном тестировании через 1 год. При скрининге с использованием количественных тестов принимают во внимание только клинически значимый результат. Для дифференциальной диагностики и наблюдения пациентов после проведения лечения дополнительная ценность одиночного количественного определения не показана. Перспективным в прогнозе риска рецидива CIN2+ является оценка динамики вирусной нагрузки после лечения (снижение или увеличение концентрации вируса).

Генотипирование вирусов папилломы человека. Цель генотипирования ВПЧ – отличие персистирующей инфекции от случая повторного инфицирования (сохранение генотипа в повторных тестах); уточнение тактики ведения больных в зависимости от онкогенности выявленных типов вируса.

Показания к обследованию. Пациенты с выявленной папилломавирусной инфекцией ВКР

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Для генотипирования ВПЧ используют МАНК. Распространение получили методики с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза (генотипирование по величине амплифицируемого фрагмента), гибридизации на плашках и стрип-полосках, ПЦР в реальном времени.

Классические методики, использующие принцип гибридизации со специфическими зондами позволяют определять наиболее широкий спектр генотипов (20–40). Однако использование для амплификации универсальных праймеров приводит к существенным различиям в аналитической чувствительности выявления различных генотипов ВПЧ, приводя к заметным искажениям результатов. Кроме того, широкий спектр определяемых генотипов необходим только для научных исследований. В клинической практике достаточным может считаться генотипирование ВПЧ ВКР (10–13 типов). Методики, основанные на применении типоспецифических олигонуклеотидов, позволяют проводить типирование спектра клинически значимых генотипов и в заметной степени лишены проблемы различий аналитической чувствительности по отношению к разным генотипам ВПЧ. Предпочтение должно отдаваться мультиплекс-методикам с использованием ПЦР в реальном времени как наиболее быстрым, контаминационно безопасным, предполагающим возможность автоматизации. Может проводиться сокращенное генотипирование с выявлением только наиболее онкогенных типов ВПЧ 16 и 18.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Для установления персистенции вируса применяют подход повторного генотипирования через 12 месяцев. Персистенция подтверждается при сохранении генотипа/ генотипов при повторном исследовании, полная смена спектра генотипов указывает на излечение и повторное инфицирование альтернативными ВПЧ. Выявление наиболее онкогенных типов ВПЧ (16 и 18) может указывать на потребность в более агрессивной тактике ведения больных (более частые повторные визиты, более тщательное обследование для выявления предраковых изменений и др.).

Выявление вирусов папилломы человека низкого канцерогенного риска

Показания к обследованию

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Для выявления ДНК ВПЧ НКР используют МАНК (ПЦР, NASBA, TMA и др.) и методы амплификации сигнала (гибридный захват). Предпочтение должно отдаваться быстрым и контаминационно-безопасным методикам, таким как ПЦР в реальном времени.

Клинически оправданным является определение двух генотипов 6 и 11 (более 90% случаев папилломатоза гортани у детей). Некоторую дополнительную ценность имеет выявление 42, 43 и 44 генотипов. Количественное определение не оправдано.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Выявление 6 и/или 11 генотипов указывает на возможный риск развития папилломатоза гортани у ребенка (риск повышается, если вирус обнаружен в гортани). При планировании беременности может быть рекомендована выжидательная тактика. При сопутствующем наличии остроконечных кондилом – их лечение методом химической и/или физической деструкции. При наличии беременности ее прерывание или родоразрешение методом кесарева сечения не оправданы, так как риск развития папилломатоза гортани ниже риска возможных осложнений указанных операций.

Источник