Для чего применяют элективные избирательные питательные среды

Классификация питательных сред

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

— Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

— Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

— Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

— Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Источник

Питательные среды для культивирования бактерий

Питательная среда микроорганизмов. Её виды

С тех пор, как были открыты микробы, и течение многих десятилетий микробиологи учились выращивать их в лабораторных условиях (а позже и условиях производства, на специальных заводах). Понятно, почему это так важно.— ведь недостаточно увидеть микробов под микроскопом, нужно изучить их образ жизни, способы питания и т. д. Собственно говоря, только с того момента, когда их научились выращивать и культивировать, микробиология стала точной наукой.

В лабораториях их выращивают на питательных средах; сейчас микробиологи располагают огромным количеством таких сред (больше тысячи). Но самой первой был сенной настой: в нем всегда в изобилии встречается множество простейших и бактерий.

Однако на такой среде могут найти себе пищу далеко не все микробы. Поэтому число жидких питательных сред быстро увеличивалось, по мере того как возникали новые и новые отрасли микробиологии: микробиология виноделия, пивоварения, молочных продуктов и т. д.

Один из основоположников науки о микробах — Луи Пастер использовал в качестве питательной среды пивное сусло, вино, виноградный сок, мясной бульон… Круг микробов, которых можно было выращивать в лаборатории, все время расширялся.

Питательные среды — субстраты, используемые в лабораторной практике для выращивания микроорганизмов и других биологических объектов. Рост микроорганизмов зависит от наличия в питательной среде достаточного количества органических и неорганических веществ в виде различных солей, витаминов и др. Питательные среды должны обладать также оптимальными физико-химическими свойствами: рН, вязкостью, влажностью, осмотическими свойствами.
Наиболее часто в качестве органического компонента питательных сред применяют продукты частичного расщепления белков — пептоны или различные мясные настои и экстракты. Эти компоненты используют при изготовлении многих так называемых обычных питательных сред, чаще всего применяемых для выращивания микробных культур, а также являющихся основой более сложных питательных сред. К числу обычных питательных сред относится мясо-пептонный бульон и бульон Хоттингера. В зависимости от вида культивируемого микроорганизма общие питательные среды содержат добавки различных бактериальных факторов роста. В одних случаях это могут быть чистые витамины, аминокислоты, в других — экстракты всевозможных натуральных субстратов. Так, например, для выращивания возбудителей бруцеллеза используются добавки перевара ткани печени, а возбудитель коклюша культивируют на средах, содержащих кровь.
К специальным питательным средам относятся среды, применяемые при необходимости избирательного выявления в исследуемом материале какого-либо вида микроорганизма или его отдельного биохимического или физиологического свойства. К числу специальных питательных сред относятся следующие.

1.Элективные, или избирательные, и обогатительные среды. В таких средах созданы благоприятные условия для развития какого-нибудь одного вида микроорганизма, размножение всех остальных видов микробов угнетается. Для этого к среде добавляют либо питательные вещества, которые может использовать только изучаемый микроб, либо различные факторы угнетения, к которым этот микроб нечувствителен. Этот тип питательных сред используется для выделения и установления природы микроорганизмов, присутствующих в исследуемом материале в очень небольшом количестве по сравнению с другими формами. Примерами избирательных сред являются среды, содержащие желчь или соли желчных кислот и бриллиантовую зелень, а также среды, содержащие селенит, которые применяются для выделения патогенных кишечных бактерий. На этих средах подавляется рост кишечной палочки. Для первичных посевов возбудителей дифтерии используют свернутую лошадиную сыворотку, на которой все другие виды микробов растут значительно медленнее.

2. Дифференциально-диагностические среды. Эти питательные среды применяются для идентификации бактериальных культур. Использование дифференциально-диагностических питательных сред основано на том, что при росте на них бактерий происходят химические изменения компонентов среды, которые легко можно наблюдать. В качестве изменяющегося компонента дифференциально-диагностических питательных сред чаще всего применяются различные белковые вещества, сахара и многоатомные спирты, в результате расщепления которых микробами изменяется реакция среды, что учитывается по изменению окраски добавленных к среде индикаторов, появлению пузырьков газа и т. п. Примерами широко используемых дифференциально-диагностических питательных сред могут служить среды так называемого пестрого ряда, применяемые для выяснения способности микробов сбраживать различные сахара (среды Гисса и др.). См. также Дифференциально-диагностические среды.

3.Синтетические питательные среды применяются в тех случаях, когда требуется изучить биохимические свойства микроорганизмов, например потребности в тех или иных факторах роста (см. Бактерии), а также при необходимости выращивать микробы в строго контролируемых условиях. Обязательными компонентами синтетических питательных сред являются неорганические соли, источники углеводов и азота (как правило, глюкоза и аммонийные соли). Особенностью синтетических питательных сред является то, что всегда известен химический состав среды, который можно изменять в соответствии с целями исследования. При изготовлении синтетических питательных сред следует соблюдать ряд предосторожностей во избежание их загрязнения следовыми количествами посторонних веществ. Так, например, следует использовать только химически чистые вещества и посуду и дистиллированную воду. В качестве примера синтетических питательных сред можно привести глюкозо-солевые среды с добавками различных аминокислот, применяющиеся для выращивания микробов кишечной группы, и среду Модели, содержащую в качестве источника азота аммонийные соли органических кислот, на которой культивируют туберкулезные бактерии.

В некоторых случаях при культивировании микроорганизмов необходимо создать условия, максимально приближающиеся к условиям их естественного обитания. Для этого используют так называемые натуральные среды. В качестве основного компонента многих питательных сред используют естественные биологические субстраты в неизмененном виде, например кровь, молоко, желчь и т. п. На натуральных питательных средах выращивают гонококки, спирохеты, менингококки и некоторые другие виды микробов. Натуральные питательные среды применяют также при культивировании клеток и тканей животного вне организма (так называемые клеточные и тканевые культуры). К числу натуральных питательных сред можно отнести также среды, используемые для культивирования вирусов, содержащие неразрушенные клетки (например, тканевые культуры и куриные эмбрионы).

По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Плотные среды получают путем свертывания натуральных биологических субстратов, например сыворотки крови, или путем добавления к соответствующим жидким средам желеобразующих веществ. Чаще всего в качестве желеобразующих веществ используют желатину или агар-агар. Добавление к жидкой среде 2% агар-агара дает плотную среду, а 0,5—0,7% — полужидкую. Плотные питательные среды используют для получения чистых культур микроорганизмов, для точного определения количества микробов в исследуемом материале и для изучения некоторых культуральных свойств и морфологии бактериальных колоний.

В питательной среде необходимо поддерживать оптимальную концентрацию кислорода. При культивировании аэробов (см.) концентрация кислорода в среде должна быть высокой, что достигается путем выращивания микробов на поверхности плотных питательных сред или благодаря аэрации жидких питательных сред. Растущие микробные культуры аэрируют либо с помощью постоянного встряхивания среды (шуттелирование), либо пропусканием через среду пузырьков стерильного воздуха. При культивировании анаэробов необходимо понизить концентрацию кислорода. В этих случаях используют следующие методы: выращивание в глубине плотных питательных сред; выращивание в жидких питательных средах под слоем масла; выращивание в атмосфере углекислоты и других газов; добавление к плотным и жидким питательным средам биологических и химических агентов, связывающих кислород.

Для поддержания оптимальной реакции питательных сред используются различные буферные растворы. Для большинства микроорганизмов оптимальная реакция среды близка к нейтральной (рН=6,5—7,5). Встречаются, однако, некоторые виды, для которых оптимальны кислые или щелочные условия (рН=5, рН=8—9 соответственно). Следует помнить, что в процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы могут изменять реакцию среды в ту или другую сторону. Реакция среды может также изменяться при стерилизации. Поэтому исходная реакция среды должна быть установлена с учетом этих факторов. Реакцию питательной среды регулируют путем добавления кислот или щелочей и контролируют по изменению цвета различных индикаторов (лакмуса, фенолфталеина и др.) или с помощью специальных приборов (рН-метров).

При приготовлении питательной среды рекомендуется пользоваться продажными компонентами, хорошо очищенными и приготовленными в стандартных условиях. Наиболее удобны сухие среды, например сухой пептон или мясо-пептонный бульон, гидролизаты казеина и др. В случае необходимости, экстракты и гидролизаты могут быть приготовлены в лабораторных условиях, однако их качество будет значительно ниже. Приготовление питательной среды производится по соответствующим прописям, после чего среда фильтруется и в ней устанавливают необходимую реакцию рН. Некоторые компоненты среды иногда следует стерилизовать отдельно и добавить к среде после охлаждения, соблюдая правила стерильности.
Все питательные среды стерилизуют во избежание прорастания в них посторонних микроорганизмов; сосуды, содержащие питательные среды, должны быть тщательно закрыты. Наиболее эффективный метод стерилизации — термообработка. Выбор метода стерилизации зависит от термостабильности компонентов питательной среды. Иногда компоненты питательной среды стерилизуют отдельно различными методами, а затем смешивают. Питательные среды, не выдерживающие высокой температуры, стерилизуют фильтрованием.

Стерильные питательные среды хранят в темных помещениях на холоде с достаточным уровнем влажности. Обычно допускается довольно продолжительное хранение питательных сред. Перед употреблением питательные среды рекомендуется прокипятить (в тех случаях, когда допустима термообработка) для удаления растворенного в них воздуха. Агаровые и желатиновые среды расплавляют в водяных банях и в таком состоянии разливают.

Расфасовка питательных сред различна в зависимости от способа их применения. Как правило, питательные среды приготовляют, стерилизуют и хранят в больших емкостях и их розлив производится непосредственно перед опытом с соблюдением правил стерильности. Жидкие питательные среды разливают по колбам и пробиркам различной емкости, твердые — по пробиркам, чашкам Петри и так называемым бактериологическим матрацам. Следует помнить, что твердые среды, заготовленные в матрацах, чашках Петри и скошенные среды — в пробирках, нельзя хранить длительное время во избежание высыхания.

На многих новых средах, например, на мясном бульоне, могли расти и некоторые микроорганизмы, вызывающие болезни человека и животных. Особенно хорошо они росли, если к бульону добавлялись такие вещества, как кровь, кровяная сыворотка, спинномозговая жидкость.

Дело в том, что при кипячении мясного бульона (а это, в общем-то, самый настоящий, съедобный бульон, только обезжиренный, с особыми пропорциями солей и потому невкусный) разрушаются некоторые вещества, содержащиеся в мясе. Вместе с кровью они вносятся вновь. Поэтому микробы-паразиты находят в такой среде те же вещества, которыми они питались и в организме. Но у жидких сред есть важный недостаток.

Если посеять на жидкую питательную среду один какой-нибудь вид микроба, то этот вид на ней и вырастет. Что посеешь, то и пожнешь, так сказать. Но если в «посевном материале» будет несколько микробных видов или бульон окажется сильно загрязненным, то на нем вырастет смесь микробов. Разобраться в этой смеси будет трудно.

Питательные среды — биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств.

Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

1. Оптимальный состав.

В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.

2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.

3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.

Для лучшего изучения характера микробных колоний.

5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.

Классификация сред

Питательные среды подразделяют по следующим признакам.

По консистенции: а) плотные (твердые) — агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие — агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие — мясопептонный бульон.

Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар — полисахарид, выделяемый из морских водорослей.

Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.

По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).

3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.

4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) — микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.

Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).

Характеристики сред

Консервирующие транспортные среды (глицериновая смесь, фосфатный буфер, тиогликолевая среда для анаэробов и др.). Предупреждают отмирание патогенных микробов и подавляют рост сапрофитов.

Среды обогащения (селективный бульон, желчный бульон, среда Мюллера, Раппопорт, среда Кауфмана, щелочная пептонная вода). Применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто используют различные красители и химические вещества — соли, желчные кислоты, теллурит калия, антибиотики, фуксин и т.д.

Элективные (селективные среды). Обеспечивают более благоприятные условия для изолируемого микроба с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.

Например, среды Плоскирева и солевой агар применяют для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической, гемолитической способности микробов.

Содержат в своем составе белковые вещества (кровь, молоко, желатин и др.).

Среды с индифферентными химическими веществами. Служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами (цитратный агар Симмонса).

Среды с углеводами (моносахариды, дисахариды, полисахариды), многоатомными спиртами (сорбит, маннит), гликозидами (салицин, инозит) для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В своем составе содержат краски, обесцвечивающиеся при восстановлении (агар Омелянского с индигокармином), а также нитраты для определения денитрифицирующей способности микроорганизмов.

Сухие питательные среды

В бактериологических лабораториях используют в основном коммерческие сухие среды. Они представляют собой высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.

Плотные среды состоят из питательной основы, агар-агара, индикаторов и других органических и минеральных веществ, улучшающих рост одних и задерживающих рост других микроорганизмов.

В качестве питательной основы сухих сред используют различные источники белка.

За рубежом сухие среды чаще всего изготавливают на мясопептонном бульоне, требующем большого расхода говяжьего мяса. В нашей стране в качестве источника белка используют гидролизаты кильки, казеина, кормовых дрожжей.

Для упаковки сухих питательных сред используют стеклянные банки из оранжевого стекла (250 г), полиэтиленовые банки (250, 500, 1000 г), а также пакеты из трехслойной ламинированной бумаги (50…200 г).

Сроки хранения в стеклянных и полиэтиленовых банках составляют 2…4 года, а в пакетах из трехслойного ламината — от 1 года до 4 лет.

Отечественная промышленность выпускает более 120 наименований различных сухих питательных сред. Крупнейшими производителями являются ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ГНЦПМ (г. Оболенск) (Меджидов М.

М. Справочник по микробиологическим питательным средам. — М.: Медицина, 2003). Наиболее часто применяют в практических лабораториях следующие среды.

Сухие дифференциально-диагностические среды

Если раньше в практике ветеринарных бактериологических лабораторий для идентификации микроорганизмов широко использовались среды Гисса, содержащие какой-либо одни углевод, то в последнее время все шире стали применяться среды, позволяющие дифференцировать микроорганизмы по двум-трем признакам.

Среда Росселя (ФГУП НПО «Питательные среды»).

Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет зеленый цвет. После посева культуры через 18…20 ч инкубации при 37 °С о ферментации лактозы судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы — по желтой окраске столбика агара.

О газообразовании заключают по появлению пузырьков, разрывам агара. Если микроорганизм не ферментирует глюкозу и лактозу, то среда остается зеленой или приобретает синий цвет.

Среда Клиглера (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала и АООТ «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет красный цвет. Скашивать необходимо так, чтобы остался столбик высотой 2.5…3 см.

Посев производят сначала в толщу среды, а затем по скошенной поверхности. Через 18…20 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты. Если микроорганизм ферментирует лактозу, то скошенная часть агара приобретает желтый цвет. При сбраживании глюкозы среда желтеет в столбике. При газообразовании — появление пузырьков и разрывы агара. В случае образования сероводорода среда приобретает черный цвет. Продуцирование индола определяют при помощи специальных индикаторных бумажек.

Двухслойный железоглюкозолактозный агар с мочевиной.

Среда Олькеницкого (ФГУП НПО «Питательные среды»). Эти среды позволяют идентифицировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород и расщеплять мочевину. С подробной инструкцией о приготовлении, способе посева микроорганизмов и учете результатов можно ознакомиться в «Справочнике по микробиологическим питательным средам» М. М. Меджидова.

Сухие элективные питательные среды

Элективный солевой агар (СА) (ФГУП НПО «Питательные среды» и ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь). Предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала. Может служить основой для приготовления желточно-солевого или молочно-солевого агара. При посеве материала на СА через 48 ч инкубации при 37 °С рост стафилококков в виде круглых колоний диаметром 2…4 мм.

Элективно-питательная среда для выделения пневмококка (пневмококк-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды»).

Предназначена для элективного выделения пневмококка из патологического материала (крови, мокроты, гноя). Готовая среда имеет коричневый цвет. Через 24…48 ч после посева материала и инкубации его при 36…38 °С в условиях «свечного сосуда» пневмококк образует на среде выпуклые колонии размером до 1 мм, хорошо отличимые от бледно-розовых колоний стафилококка.

Среда подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (кишечной палочки, протея, стафилококка).

Рекомендуется для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий из мочи, а также может быть использован при бактериологическом исследовании пищевых продуктов, фекалий, сточных вод.

Готовая среда красно-коричневого цвета, прозрачная, с легкой опалесценцией. Через 16…20 ч инкубации посева при 37 °С лактозоотрицательные сальмонеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, лактозоположительные эшерихии — колонии ярко-малинового цвета.

Среда подавляет «роение» протеев, которые растут в виде бесцветных изолированных колоний в О-форме. Рост стафилококков полностью подавляется.

Питательные среды других групп

Гликолевая среда (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала; ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для контроля стерильности медицинских и биологических препаратов. Учет результатов проводят согласно инструкции «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту».

Питательные среды № 1 и 2 выпускают ФГУП НПО «Питательные среды» (г.

Махачкала) и ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая № 1.

Используют для определения общей обсемененности нестерильных лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

Питательная среда для контроля микробной загрязненности (Сабуро-агар) № 2.

Рекомендуется для культивирования грибов, а также определения содержания грибов в нестерильных лекарственных средах и других объектах внешней среды.

Эритрит-агар и эритрит-бульон.

Предназначен для выделения и культивирования бруцелл.

Питательная среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба.

Кетоглутаровый агар. Эффективен для изоляции и культивирования возбудителя туляремии.

Питательная среда для листерий. Рекомендуется для изоляции листерий из инфицированного материала (кровь, ликвор, околоплодные воды и др.) и культивирования штаммов.

Предложена для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузным методом.

Питательная среда для экспресс-определения антибиотикочувствительности условно-патогенных бактерий. Предложена для ускоренного определения антибиотикочувствительности грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов. Учет результатов можно проводить через 4…5 ч.

Ассортимент выпускаемых отечественной промышленностью сухих питательных сред постоянно расширяется.

Приведено лишь небольшое количество тех, которые могут быть использованы в повседневной работе ветеринарных лабораторий. Кроме того, в настоящее время имеется возможность приобретать и импортные питательные среды.

Коммерческие названия можно узнать, заказав соответствующие каталоги. Однако их внедрение и широкое использование в ветеринарных лабораториях РФ возможно лишь в отдаленной перспективе из-за довольно высокой стоимости. Кроме того, в этой главе не упомянуты готовые коммерческие питательные среды довольно хорошего качества производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Они расфасованы во флаконы по 400 мл; срок хранения 1 год. Среды, безусловно, могут быть полезны при проведении бактериологических работ в полевых условиях.

Питательные среды, принципы их классификации, требования, предъявляемые к питательным средам, условия культивирования микроорганизмов.

Основой бактериологических работ являются питательные среды, нередко определяя своим качеством результаты исследования.

Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

1.Питательные среды должны содержать все необходимые для питания микроба питательные вещества, т.е. обладать питательностью.

2. Иметь достаточную влажность

3. Иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды.

4. Обладать изотоничностью (концентрация NaCl 0,87%), для галофильных бактерий концентрация соли 1% и выше.

5. Иметь оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

6. Быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий, особенно в жидких средах.

7. Быть стерильными (чтобы не было других бактерий).

Для приготовления питательных сред используют продукты животного происхождения (мясо, рыба, кровь, яйца, молоко) и продукты растительного происхождения (картофель). Также используют синтетические питательные среды, составленные из химических соединений.

Источником азота для бактерий служат простые аммонийные соединения, аминокислоты или пептоны; источником углерода – сахар, многоатомные спирты, органические кислоты.

Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН2РО4, К2НРО4.

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть: жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара. Агар- полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 оС, остывает при температуре 45-50 оС.

Для полужидких сред агар добавляют в концентрации 0,5%, для плотных – 1,5-2%. Жидкие среды не содержат агар-агара.

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Хоттингера. Сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (сахарный, сывороточный, желчный бульоны, кровяной, сывороточный, желточно-солевой агары, среда Кита-Тароцци, Вильсона-Блера).

В зависимости от назначения среды подразделяются:

1.Общего назначения –для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, кровяной агар).

2. Специального назначения:

а) элективные среды – это среды, на которых растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холерного вибриона.

б) среды обогащения – это такие среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других.

Например, магниевая и селенитовая среды стимулируют рост бактерий рода сальмонелла, ингибируя рост кишечной палочки.

в) дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий (среды Гисса).

г) комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры и дифференциально-диагностическую (среда Плоскирева для выделения шигелл, висмут-сульфитный агар – для сальмонелл).

Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

С целью дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий используют селективные среды. Прототрофы растут на минимальной среде, содержащей только соли и углеводы, так как они сами способны синтезировать нужные им для развития метаболиты. Ауксотрофы нуждаются в средах, содержащих определенные аминокислоты, витамины, т.е. факторы роста.

Приготовление питательных сред – один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической работы.

В настоящее время медицинской промышленностью организовано производство консервированных сред.

Сухие питательные среды находятся в пластмассовых банках с плотно завинчивающимися крышками, обеспечивающими герметичность.

Условия культивирования бактерий

1.Наличие полноценной питательной среды.

2. Определенная температура культивирования (оптимальная температура 370С).

3. Определенная атмосфера культивирования. Для строгих аэробов необходим кислород, поэтому они хорошо растут на поверхности агара чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для роста аэробов в глубинном слое жидкой среды необходимо непрерывно перемешивать или встряхивать питательные среды, чтобы кислород распределялся по всему объему среды.

Для факультативных анаэробов используют те же методы. Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Концентрация СО2 должна быть 1-5%. Для этого используют специальные СО2 –инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горячую свечу.

Для роста облигатных анаэробов необходимо исключить доступ кислорода. Для этого добавляют к питательным средам редуцирующих кислород веществ (тиогликолевая кислота), регенерация от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения, использование поглотителей кислорода, помещая их в герметически закрываемые емкости «газпаки», использование анаэростатов.

Время культивирования (18-48 часов). Для культивирования микобактерий туберкулеза (3-4 недели).

5. Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет.

6. Культивирование облигатных внутриклеточных паразитов-бактерий, относящихся к родам риккетсия, эрлихия, коксиелла, хламидия осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах.

В промышленных условиях для получения биомассы бактерий или грибов с целью получения антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов культивирование осуществляется в аппаратах (ферментерах) при строгом соблюдении оптимальных параметров роста и размножения культур.

Питательные среды для культивирования бактерий

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур.

Источник