Бациллюс лихениформис что это
ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КУЛЬТУРЫ ВИДА BACILLUS LICHENIFORMIS
B. licheniformis является частью группы subtilis вместе с Bacillus subtilis и Bacillus pumilus. Общеизвестно, что эти бактерии вызывают пищевые отравления и порчи продуктов. B. licheniformis также известен как агент, загрязняющий молочные продукты. Вспышки отравлений пищевого происхождения обычно включают случаи употребления в пищу вареного мяса и овощей, сырого молока и детского питания промышленного производства, загрязненных B. licheniformis [2].
Бактерия, обычно встречаются в почве в споровой форме. Ее находят на перья птиц в местах обитания птиц как воздушных, сухопутный, так и водных видов.
Были изучены морфологические, тинкториальные, культуральные и некоторые биохимические свойства штамма B. licheniformis полученногоиз музея кафедры Микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы УГСХА им. П.А. Столыпина.
Материалы и методы. Набор для окраски по Граму, среды Гисса, 0,7% мясопептонный агар, 1,2 % мясопептонный агар (ГРМ), мясопептонный бульон (ГРМ), 3% раствор перекиси водорода, 1 % раствор тетраметилпарафенилендиамина дигидрохлорида. световой микроскоп МБИ-3, бактериологическая петля, цифровая камера-окуляр для микроскопа модель DCM 130, термостат ТС 1/80 СПУ, штативы, пробирки, пробки, предметные стекла, вода дистиллированная, автоклав ВК-75, штамм B. licheniformis ( музея кафедры «Микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы» УГСХА им. П.А. Столыпина). Исследование проводили стандартными бактериологическими методами, многократно апробированном сотрудниками кафедры МВЭиВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновской ГСХА 7.
Суточную бульонную культуру B. licheniformis высеяли на мясопептонный агар (ГРМ), в пробирки со средами Гисса, полужидкий агар. Посевы культивировали при 30 ºС сутки, затем учитывали некоторые результаты: реакция сред Гисса, подвижность (рост в полужидком агаре), характер роста на мясопептонном агаре. Затем были поставлены по стандартным методикам тесты на определение способности продуцировать ферменты каталазу и оксидазу, приготовлен мазок и окрашен по Граму.
В результате проведенных исследований, установлено, что исследуемая культура B. licheniformis каталазоотрицательная, оксидазоотрицательная (рисунок 1). Глюкозо-, лактозо-, мальтозо-, маннит-, инулин-положительная, сорбит-, дульцит-отрицательная (рисунок 2). Штамм B. licheniformis неподвижен, рост в полужидком ангаре по уколу равномерно по всей высоте столбика, что говорит о том, что данной культура является факультативном анаэробом (рисунок 3).
В мазке, окрашенном по Граму культура представлена грамотрицательными палочками расположенные одиночно, попарно или цепочкой, эндоспоры овальные, расположены центрально.
На мясопептонном агаре через сутки культивирования образует серовато-белые морщинистую форму колоний с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции (рисунок 4).
Рисунок 1 – Отрицательный результат простановки теста на наличие ферментов каталазы и оксидазы у культуры B. licheniformis
На мясопептонном бульоне рост сопровождается обильным равномерном помутнением среды, образованием белого мелкозернистого осадка, при встряхивании поднимающегося косой.
Выводы: в результате проведенной работы, установлено, что штамм B. licheniformis по исследуемым культуральным, морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам в целом, является типичным представителем вида B. licheniformis.
Список используемых источники:
2. Salkinoja-Salonen S., Vuorio R., Andersson M.A., Kämpfer P., Andersson M.C., Honkanen-Buzalski T., and Scoging A.C. Toxigenic Strains of Bacillus licheniformis Related to Food Poisoning.Appl Environ Microbiol. 1999 October; 65(10): 4637–4645.
4. Садртдинова Г.Р. Сравнительная эффективность методов выделения бактериофагов Klebsiellaoxytoca/ Г.Р. Садртдинова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин/ Вестник Ульяновской сельскохозяйственной академии.-№4 (32).- С.68-72.
5. Садртдинова Г.Р. Выделение бактериофага бактерий Klebsiellaoxytoca под действием рентгеновского облучения/ Г.Р.Садртдинова, Д.А.Васильев, С.Н.Золотухин // Вестник Ульяновской сельскохозяйственной академии.-№1 (33).- С.76-81.
6. Ефрейторова Е.О., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Изучение биологических свойств бактерий serratia marcescen выделенных из пищевых продуктов и объектов окружающей среды / Научный вестник Выпуск №13.г. Дмитровград. Технологический институт филиал ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина» С. 175-180
7. Пульчеровская Л.П. Индикация бактерий рода Citrobacter с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ)/ Л.П.Пульчеровская, С.Н.Золотухин, Д.А.Васильев// Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2013. – № 1(21). – С. 60 – 64.
Бактерия Bacillus licheniformis (штамм ATCC 14580) и ее геном
textназадСведения о бактерии:
Вид B.licheniformis относят к роду Bacillus, семейству Bacillaceae, порядку Bacillales, классу Firmicutes, царству Bacteria. (link)
Чем интересна B.licheniformis и зачем был секвенирован ее геном?
Bacillus licheniformis относится к разряду полезных почвенных бактерий, которые образуют гумус из животных и растительных остатков (является бактерией-сапрофитом, то есть извлекает питательные вещества из разлагающегося материала). При недостатке питания спорализуется, что делает ее устойчивой к нагреванию, охлаждению, высушиванию, воздействию радиации и позволяет выжить в неблагоприятных условиях. При улучшении условий споры прорастают.
Bacillus licheniformis выделена из почвы в экологически чистых районах Сибири. Дружественна организму любого млекопитающего.
Этот организм является близкородственным к Bacillus subtilis (исходя из типа рРНК).
Она выполняет роль дезинфектанта в почве, растениях, организме теплокровных и хладнокровных животных и человека. Именно это дало возможность растениям и животным приспособиться к жизни на Земле и занять свою экологическую нишу. Не будь этой и подобной ей бактерий высшие организмы погибли бы от инфекций, не успев сформироваться как вид.1
Различные штаммы Bacillus licheniformis входят в состав лекарственных препаратов. В отличие от антибиотиков, в качестве действующего начала в этих препаратах используются живые бактерии, поэтому в организме не убивается все живое, как в случае с антибиотиками. Препараты с живыми бактериями Bacillus licheniformis подавляют патогенную, условно-патогенную и гнилостную микрофлору и обеспечивают возможность роста и развития нормальной микрофлоры кишечника. Этот механизм сформировался за миллионы лет эволюции живого на нашей планете. Древние люди получали эту бактерию при контактировании с почвой, пылью и при съедании грязной пищи. В современных условиях эти способы поступления Bacillus licheniformis в организм человека утратили свое значение. Поэтому человеку приходится пополнять свои запасы этой бактерии посредством приема лекарственных препаратов.
Штамм бактерий bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и касается получения штаммов пробиотиков.
Известно, что аэробные спорообразующие бактерии характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных бактерий, что позволяет использовать их в составе пробиотиков. Среди пробиотиков, широко применяемых в медицинской и ветеринарной практике, все большее распространение получают препараты, основой которых являются бактерии рода Bacillus.
Известен бактериальный штамм Bacillus licheniformis 31 [7], характеризующийся антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно патогенных бактерий и являющийся факультативным аэробом. Благодаря этому он способен расти и проявлять антимикробные свойства в условиях с пониженным содержанием кислорода, но не обладает выраженной антивирусной активностью.
Поставленная задача решается путем трансформации штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pBMB 105, кодирующей синтез альфа-2-интерферона человека.
Получение компетентных клеток и трансформацию плазмидной ДНК проводят известным методом [3]. Трансформанты высевают на чашки с селективной средой, содержащей канамицин (10 мкг/мл) и выращивают при 37 o C 24 часа. Сконструированный штамм Bacillus licheniformis 2336/105 характеризуется следующими признаками: Морфологические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях, не гидролизует мочевину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Растет в присутствии 10% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. При росте на МПБ образует аммиак, не образует сероводород и индол. Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитиназной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона и выражают в международных единицах (ME).
Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что образцы культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis 2336/105 при выращивании в микроаэрофильных условиях обладают антивирусной активностью в отличие от штаммов-аналогов.
Сконструированный штамм характеризуется также высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, как и исходная культура Bacillus licheniformis 31 (табл. 2).
Безвредность нового штамма Bacillus licheniformis изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (результаты представлены в таблице 3.1. ), вирулентность (табл. 3.2), токсичность (табл. 3.3) в сравнении с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.
Введение суспензии живых клеток 24-часовой культуры перорально в дозах 1-10 млрд. микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 млрд. микробных клеток/на мышь не вызывает у животных каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявляет у них патологических изменений, регистрируемых микроскопически.
Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма Bacillus licheniformis 2336/105 на мясо-пептонном бульоне) не выявляет у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.
Таким образом, полученные данные дают основание отнести сконструированный штамм к 4-му классу по классификации, приведенной в методических указаниях МЗ СССР, главного санитарно-эпидемиологического управления «Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов и на их основе готовых форм препаратов. «, /М., 1983/, т.е. к микроорганизмам, практически не обладающим аллергенным и общетоксическим действием.
Стабильность рекомбинантной плазмиды pBMB 105 в штамме Bacillus licheniformis 2336/105 определяют следующим образом: клетки Bacillus licheniformis 2336/105 выращивают в 5 мл среды 2xLB с крахмалом до стационарной фазы; затем 0,5 мл выросшей культуры переносят в 4,5 мл свежей среды 2xLB и вновь выращивают до стационарной фазы; проводят 5 пересевов, причем после каждого пересева проводят высев на МПА без антибиотика. Выросшие изолированные колонии перекапывают на чашки с МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр. После подкрашивания подсчитывают и сравнивают число колоний, выросших на МПА с антибиотиком и без антибиотика. Таким образом определяют количество клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду после каждого пересева. Отсутствие плазмиды подтверждают методом выделения плазмидной ДНК.
Сохранность гена интерферона человека типа альфа-2 в рекомбинантной плазмиде pBMB 105 после пересевов подтверждают методом гибридизации: нитроцеллюлозные фильтры с отпечатками колоний после пересевов инкубируют с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона альфа-2, выделенным из плазмиды pBMB 105. Все клоны, не потерявшие рекомбинантные плазмиды после пересевов, гибридизуются с меченым фрагментом, что свидетельствует о сохранности гена интерферона в составе плазмиды pBMB 105. Кроме того, из случайно отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью эндонуклеаз рестрикции. В результате описанных экспериментов установлено, что рекомбинантная плазмидная ДНК рBMB 105 сохраняется и наследуется в течение 5 пересевов на МПА без селективного давления.
Таким образом, впервые получен штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью в микроаэрофильных условиях, который может служить основой для создания препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекционных заболеваний смешанной этиологии у животных и человека.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения: Пример 1. Получение штамма Bacillus licheniformis 2336/105. Трансформацию штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pMB 105 проводили стандартным методом [3]. Для выделения плазмид из штаммов бацилл известная методика [9] была модифицирована. Изменения были введены на основании экспериментов по изучению влияния различных составов лизирующих буферов и времени обработки клеток бацилл для достижения более полного лизиса и максимального выхода плазмидной ДНК. Период инкубации с лизоцимом был увеличен с 20 мин до 40 мин.
Пример 2. Определение антивирусной активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Для определения антивирусной активности штамма, детерминируемой интерфероном, готовят опытные образцы культуральной жидкости.
Для сравнения и в качестве контроля используют штаммы-аналоги: родительский Bacillus licheniformis 31 и рекомбинантный Bacillus subtilis ВКПМ-475.
Пример 3. Определение антагонистической активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Антагонистическую активность исследуют методом радиальных штрихов [4]. 18-часовую культуру Bacillus licheniformis 2336/105 высевают в центр чашки диаметром 12 см на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 суток инкубирования при 28 o C подсевают по радиальным штрихам тест-культуры на бактериальной суспензии 5 х 10 кл/мл. Зоны отсутствия роста учитывают через 18-24 часа инкубирования. Контролем служат чашки без культуры B.licheniformis.
результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о сохранении антагонистических свойств у рекомбинантного штамма по сравнению с исходным родительским штаммом.
Пример 4. Изучение безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Безвредность штамма изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (табл. 3.1), вирулентность (табл. 3.2.), токсичность (табл. 3.3), сравнивая с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.
Наблюдения за животными проводят на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или перорального введения. В период наблюдений все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и контрольные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты микроскопическому изучению.
Результаты экспериментов свидетельствуют о безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105 для теплокровных.
Литература:
1. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал, 1993, Т. 55, N 4 с. 92-112.
2. Патент РФ 1839459, кл. C 12 N 1/21, 1990 г.
5. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал 1992, Т. 54, N 6, с. 82-94.
6. А.с.СССР 1722502, кл. A 61 K 39/02, 1989г.
9. Бациллы. Генетика и биотехнология. //Под редакцией К.Харвуда, М., «Мир», 1992, с. 460.
Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью.
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью «Диафарм»
Договор № РД0068088 зарегистрирован 05.08.2010
PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)
Адрес для переписки:
630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н., р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Пробиотики
Слово «пробиотик» вошло в обиход фармацевтов, врачей и технологов пищевых производств не так давно — в конце 70-х годов 20 века. Оно образовано от латинских корней pro + bio, что дословно значит «для жизни». Пробиотиками называют полезные для человека и животных микроорганизмы (как правило, бактерии, реже — дрожжевые грибки), составляющие микрофлору здорового кишечника.
В случае стрессов, болезней и лечения сильнодействующими препаратами, количество микроскопических «жителей» сокращается, что приводит к развитию патогенной среды — благоприятной для вирусов и микробов. Восстановить равновесие можно, приняв «помощников» внутрь. Чаще всего для этого используются различные штаммы лактобацилл и бифидобактерий, а также энтерококки, спорообразующие аэробные бактерии и другие бактерии или их смеси.
В последнее время пробиотики стали добавлять не только в продукты для людей, но и готовые корма для собак и кошек. Конечно, если питомцы страдают от серьёзных кишечных расстройств и эндокринных заболеваний, дозы пробиотиков в корме будет мало — для улучшения здоровья потребуются специальные препараты. Однако такая добавка будет нелишней для профилактики кишечных нарушений и укрепления иммунитета здоровых животных.
Разумеется, больше доверия вызывают ингредиенты с максимально полной информацией, поэтому ответственный производитель обязательно укажет, какие именно микроорганизмы или их сочетание он добавил в формулу корма и в каком количестве. Бактерии принято исчислять в КОЕ (колониеобразующих единицах), или в международном обозначении на латинице — CFU.
В идеале, после них должен ещё прописываться специальный код из латинских букв и цифр, который маркирует выращенную в лаборатории колонию микроорганизмов. Некоторые производители дополнительно сообщают о том, в какой форме ими были задействованы пробиотики (в жидкой или сухой). Если же в составе корма, кроме общего названия, нет никаких данных о «пробиотиках», трудно поручиться, что такой ингредиент принесёт пользу организму питомца.
Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма
Владельцы патента RU 2440413:
Изобретение относится штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающего антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на их основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений. Штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 получены методом направленной селекции и депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационными номерами ВКПМ соответственно: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. Препарат характеризуется содержанием наполнителя с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, или ВКПМ В-10562, или ВКПМ В-10563, или ВКПМ В-10564, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г или 1·10 3 КОЕ/мл. В качестве наполнителя он содержит воду или порошкообразный сорбент. Изобретение позволяет повысить эффективность восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширить спектр антибактериальной и фунгицидной активности. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 табл.
Изобретение относится к штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающему антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на его основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений для получения препаратов против бактериальных и грибных инфекций животных и растений, а также для использования в качестве микробиологических удобрений и пробиотиков для восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Препарат Фитоспорин-М (порошок на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень), бобовых (горох), овощных культур (картофель, капуста, томаты, огурцы), (патент РФ №2129375, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 27.04.1999 г.).
Препарат Бактофит (смачивающийся порошок на основе штамма ИПМ 215 Bacillus subtilis) предназначен для защиты от болезней овощных и цветочных культур, выращиваемых в открытом и защищенном грунте, а также черной смородины от мучнистой росы.
Среди микробиологических удобрений аналогом заявляемого препарата является препарат Бактофосфин, основу которого составляют почвенные микроорганизмы Bacillus mucilaginosus, предназначенный для обогащения почвы усвояемыми растениями формами фосфора, а также восстановления ее плодородия, повышения всхожести и урожайности многих видов сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте. Авторами данного удобрения не приводятся конкретные данные по влиянию на показательные для плодородных почв группы микроорганизмов, а также влияния на урожайность культур.
Микробиологическое удобрение Байкал Эм-1 содержит консорциум представителей различных групп микроорганизмов, в том числе грибов, которые, развиваясь в почве при внесении как симбиотическое сообщество, призваны увеличить численность почвенной микрофлоры и, соответственно, плодородие и урожайность.
Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибковых возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при хранении (Авторское свидетельство СССР №1706504, кл. А01N 63/00, 1992 г.) [2].
Однако данный штамм также оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7036, предназначенный для получения препарата против грибных болезней растений (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.). Штамм подвергался селекции на подавление бактериального роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: Phytophthore infestans, Microsporium solani, Fusarium solani (возбудитель сухой гнили).
Однако штамм-прототип и препарат на его основе обладают недостаточно широким спектром антагонистической активности, а также не исследовался на способность восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Техническим результатом заявляемых технических решений является обеспечение восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширение спектра антибактериальной и фунгицидной активности.
Указанный технический результат достигается путем получения методом направленной селекции четырех вариантов бактериальных штаммов Bacillus licheniformis: IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2, обеспечивающих восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающих бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированых от 18.03.2010 г. во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика соответственно под №ВКПМ: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. (справки о депонировании прилагаются).
Исходные клоны для получения заявляемых штаммов были выделены из здоровых животных в экологически чистом районе Новосибирской области (Завьяловский бор):
— штамм Bacillus licheniformis: IC-831-1-2 выделен из фекалий гуся,
— штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2 выделен из фекалий коровы,
— штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2 выделен из фекалий гуся,
— штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2 выделен из фекалий курицы.
Исходные клоны подвергались селекции на подавление бактериального и грибного роста. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода Candida, возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины.
Иммобилизация спор бактерий на крахмале обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает агрегирование спор и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.
При применении препарата крахмал способствует ускорению прорастания спор бактерий, что повышает эффективность его действия.
Кроме того, использование заявляемых компонентов препарата значительно упрощает технологию его получения как на этапах культивирования (в технологии отсутствует использование дорогих ферментов, не требуется очистка и концентрирование препарата), так и на этапах получения его готовой формы (удаление и перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата).
Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Штаммы относятся к грамположительным факультативно анаэробным палочковидным бактериям. При росте на мясо-пептонном агаре дают морщинистую форму колоний с обильным образованием слизи и выделением розовато-красного пигмента в верхний слой среды под колонией. Колонии кремово-розовые. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки (1,09-1,96) мкм, ширина (0,36-0,97) мкм. Капсулу не образуют, выделяют большое количество слизи. По Граму окрашиваются положительно. Штаммы являются термофильными, размножаются при (35-65)°С, оптимальный рост при температуре (37-40)°С.
Через 48 часов роста при 40°С на мясо-пептонном агаре культуры имеют непрозрачные колонии неоднородной консистенции, со слизистыми включениями и волнистым краем, вросшие в поверхность агаровой пластинки. pH среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 6,5-7,0. Штаммы размножаются при 40°С на мясо-пептонном агаре и мясо-пептонном бульоне.
Биохимические свойства штаммов. Они не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Не обладают лецитиназной активностью. Обладают каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне (1-9) %.
Штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.
Штаммы продуцируют биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры.
При длительном хранении штаммов споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерий используют мясо-пептонный бульон, культивирование проводят при температуре 40°С.
Пример 1. Исследование непатогенности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Исследование проведено в лаборатории биотехнологического контроля НПФ «Исследовательский центр».
Патогенность каждого микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, их внешнему виду и поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.
В работе использованы лабораторные животные двух видов: нелинейные белые мыши массой (18-20) г в количестве 40 особей обоего пола и крысы породы Вистар массой (180-200) г в количестве 40 особей обоего пола. Из животных формировали опытную и контрольную группу по 20 особей в каждой. Для выявления проникновения бактерий в органы экспериментальных животных животным из опытных групп на протяжении 60 суток перорально вводили суточную культуральную жидкость бактерий, полученную путем культивирования исследуемого штамма на мясо-пептонном бульоне.
Животных из опытных и контрольных групп забивали по следующей схеме:
После проведения вскрытия посевы из органов (сердце, легкое, печень, селезенка) и крови производили на мясо-пептонный и кровяной агары в чашки Петри методом отпечатков. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24 часов. Результаты учитывали по наличию/отсутствию колоний на поверхности питательной среды в чашке Петри.
В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов во все периоды проведения вскрытий патологических изменений не обнаружено.
Микробиологический анализ показал, что внутренние органы и кровь были стерильными в опытном и контрольном вариантах во все периоды проведения исследований.
На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении, на протяжении 60-дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа сердца, легких, печени, селезенки и крови сделан вывод, что штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 являются непатогенными.
Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Полученные путем селекции штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяли методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp.
Используемые тест-штаммы удовлетворяли следующим требованиям: находились в S-форме, имели типичные морфологические и ферментативные свойства.
Исследование антагонистической активности заявляемых штаммов Bacillus licheniformis производили на мясо-пептонном агаре.
Рецептура мясо-пептонного агара на 1 дм 3 :
Учет результатов проводили через 8 часов инкубирования при (37±1)°С по величине зон угнетения роста тест-штаммов. Контролем роста культур патогенов служил их параллельный высев на чашки Петри с той же плотной средой (мясо-пептонным агаром), но без исследуемой ассоциации антагониста. В результате проведенных исследований установлено, что штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 1).
Таблица 1. Характеристика штамма B. licheniformis IC-831-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов Наименование тест-штамма Размер зоны (мм) Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1126-4-1 13 Staphylococcus aureus IC-1142-4-1 15 Staphylococcus aureus IC-1192-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1200-4-1 8 Staphylococcus aureus IC-1246-4-1 10 Staphylococcus aureus IC-1120-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1128-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1257-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1249-4-1 13 Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 20 Staphylococcus aureus IC-1149-4-1 15 Staphylococcus aureus IC-1241-4-1 30 Staphylococcus aureus IC-1251-4-1 23 Staphylococcus aureus IC-1226-4-1 20 Staphylococcus aureus IC-1230-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1140-4-1 22 Staphylococcus aureus IC-1222-4-1 15 Staphylococcus aureus IC-1165-4-1 18 Staphylococcus aureus IC-1205-4-1 17 Staphylococcus haemoliticus IC-1256-4-2 20 Staphylococcus aureus IC-1232-4-1 14 Staphylococcus aureus IC-1167-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1131-4-1 7 Staphylococcus aureus IC-1259-4-1 7 Staphylococcus aureus IC-1243-4-1 7 Staphylococcus aureus IC-1274-4-1 30 Staphylococcus aureus IC-1231-4-1 12 Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 15 Staphylococcus aureus IC-1234-4-1 10 Staphylococcus haemoliticus IC-1258-4-2 8 Candida albicans штамм IC-1124-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1172-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1152-9-1 12 Candida albicans штамм IC-1155-9-1 11 Candida albicans штамм IC-1143-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1141-9-1 13 Candida albicans штамм IC-1134-9-1 30
Продолжение таблицы 1 Candida albicans IC-53-9-1 12 Candida albicans IC-1147-9-1 10 Candida albicans IC-1150-9-1 11 Candida albicans IC-1203-9-1 11 Candida albicans IC-1195-9-1 10 Candida krusei IC-1244-9-2 15 Candida albicans IC-1144-9-1 15 Candida albicans IC-1132-9-1 10 Candida albicans IC-1130-9-1 20 Candida albicans IC-1156-9-1 30 Candida albicans IC-1122-9-1 30 Candida albicans IC-26-9-1 10 Candida albicans IC-1150-9-1 30 Candida albicans IC-55-9-1 11 Candida albicans IC-1119-9-1 9 Candida albicans IC-1240-9-1 10 Candida albicans IC-1166-9-1 10 Candida albicans IC-1137-9-1 14 Candida albicans IC-1186-9-1 10 Klebsiella pneumonia штамм IC-27-10-1 6 Shigella flexneri IC-815-14-2 7 Shigella sonnei IC-47-14-1 5 Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45- 13-1 8 Serratia marcescens IC-1170-17 12 Escherichia coli IC-1184-5-1 10 Escherichia coli IC-1273-5-1 8 Escherichia coli IC-1429-5-1 3 Escherichia coli IC-1427-5-1 30 Escherichia coli IC-1151-5-1 7 Enterococcus spp. IC-1236-16 15 Enterococcus faecium IC-1253-16-1 30 Enterococcus spp. IC-1163-16 15 Enterococcus spp. IC-1164-16 30 Enterococcus spp. IC-1423-16 10 Enterococcus spp. IC-1168-16 10 Enterococcus spp. IC-1175-16 12
Штамм В. licheniformis IC-832-1-4 характеризуется следующими показателями зон (мм) задержки роста тест-штаммов патогенов (таблица 2).
Таблица 2. Характеристика штамма B. licheniformis IC-832-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов Наименование тест-штамма Размер зоны (мм) Candida albicans штамм IC-1124-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1172-9-1 30 Candida albicans штамм IC-53-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1147-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1203-9-1 20 Candida albicans штамм IC-1136-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1195-9-1 20 Candida krusei штамм IC-1244-9-2 18 Candida albicans штамм IC-1144-9-1 20 Candida albicans штамм IC-1132-9-1 8 Candida albicans штамм IC-1130-9-1 15 Candida albicans штамм IC-1156-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1122-9-1 30 Candida albicans штамм IC-26-9-1 8 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-55-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1119-9-1 15 Candida albicans штамм IC-1155-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1186-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1143-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1141-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1134-9-1 30 Pseudomonas aeruginosa штамм IC-1210-7-1 12 Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 7 Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 5 Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 30 Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 30 Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 30 Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 0 Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 24 Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 8 Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 25 Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 23 Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 22 Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 24 Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 12
Продолжение табл.2 Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 11 Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 12 Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 11 Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 30
Штамм B. licheniformis IC-833-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 3).
Таблица 3. Характеристика штамма B. licheniformis IC-833-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов Наименование тест-штамма Размер зоны (мм) Candida albicans штамм IC-1124-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1172-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1143-9-1 30 Candida albicans штамм IC-53-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1147-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1203-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1195-9-1 8 Candida krusei штамм IC-1244-9-2 6 Candida albicans штамм IC-1144-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1132-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1130-9-1 20 Candida albicans штамм IC-1156-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1133-9-1 8 Candida albicans штамм IC-1122-9-1 30 Candida albicans штамм IC-26-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-55-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1119-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1139-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1141-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1240-9-1 10 Candida albicans штамм IC-1152-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1155-9-1 30 Klebsiella pneumonia штамм IC-43-10-1 6
Продолжение табл.3 Klebsiella pneumonia штамм IC-31-10-1 9 Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 12 Shigella sonnei штамм IC-1216-14-1 30 Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 30 Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-25-4-1 7 Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 26 Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 18 Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 18 Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 7 Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 8 Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1258-4-2 5 Staphylococcus aureus штамм IС-1230-4-1 12 Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 24 Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 9 Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 17 Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 18 Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 16 Escherichia coli штамм IC-1153-5-1 8 Escherichia coli штамм IC-34-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-1148-5-1 7 Escherichia coli штамм IC-36-5-1 6 Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 20 Escherichia coli штамм IC-1151-5-1 6 Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 16 Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 30 Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 30 Enterococcus spp. штамм IC-1423-16 8 Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 8 Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 10
Штамм B. licheniformis IC-834-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 4).
Таблица 4. Характеристика штамма B. licheniformis IC-834-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов Наименование тест-штамма Размер зоны (мм) Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 14 Candida albicans штамм IC-1124-9-1 18 Candida albicans штамм IC-1172-9-1 9 Candida albicans штамм IC-1152-9-1 12 Candida albicans штамм IC-1155-9-1 14 Candida albicans штамм IC-1143-9-1 12 Candida albicans штамм IC-1141-9-1 15 Candida albicans штамм IC-1134-9-1 30 Escherichia coli штамм IC-1250-5-1 5 Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 9 Candida albicans штамм IC-53-9-1 12 Candida albicans штамм IC-1147-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1203-9-1 15 Salmonella enteritidis штамм IC-1159-6-1 5 Candida albicans штамм IC-1136-9-1 7 Candida albicans штамм IC-1195-9-1 10 Candida krusei штамм IC-1244-9-2 14 Candida albicans штамм IC-1144-9-1 15 Candida albicans штамм IC-1132-9-1 12 Candida albicans штамм IC-1130-9-1 13 Candida albicans штамм IC-1156-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1122-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1150-9-1 30 Candida albicans штамм IC-55-9-1 30 Candida albicans штамм IC-1119-9-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 20 Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 16 Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 17 Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 17 Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 15 Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 16 Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 15 Escherichia штамм coli IC-1153-5-1 10
Продолжение табл.4 Escherichia штамм coli IC-1184-5-1 5 Escherichia штамм coli IC-1273-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-1193-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-1116-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-1424-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-1238-5-1 5 Escherichia coli штамм IC-36-5-1 7 Enterococcus spp. штамм IC-1163-16 8 Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 19 Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 8 Escherichia coli штамм IC-1430-5-1 7 Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 10 Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 30 Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 18 Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 18 Staphylococcus aureus штамм IC-1256-4-2 20 Candida albicans штамм IC-1133-9-1 8 Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 30 Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 20 Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 22 Staphylococcus aureus штамм IC-1131-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1259-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1243-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1179-4-1 9 Staphylococcus aureus штамм IC-1125-4-1 8 Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 30 Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 20 Candida albicans штамм IC-1154-9-1 22 Staphylococcus aureus штамм IC-1229-4-1 8 Candida albicans штамм IC-1202-9-1 6 Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 8 Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 10 Staphylococcus aureus штамм IC-1258-4-2 8 Enterococcus app. штамм IC-1423-16 10 Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 10 Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 12
Таким образом, исследуемые штаммы бактерий проявляют антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Пример 3. Методика культивирования бактерий Bacillus licheniformis для получения микробной биомассы
Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:
Пример 4. Получение готовой формы препарата на основе бактерий штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Остаточная влажность препарата составляет не более 5%.
Пример 5. Составы препаратов
Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·10 3 КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с цеолитом с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:100.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-832-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-833-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:50.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-834-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2, IC-834-1-2 в соотношении 1:1:1:1 с титром спор каждого вида бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе глюкозы в соотношении 1:20.
Пример 6. Данные по хранению сухой формы препарата на основе штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Для установления срока годности и условий хранения препарата проведены соответствующие исследования.
В течение 48 месяцев хранения сухой формы препарата при температуре (30±0,5)°С титр и антагонистическая активность препарата не изменились, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в ветеринарной медицине и растениеводстве.
Пример 7. Данные по ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении фитопатогенов.
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении способности ингибировать фитопатогенов использовали метод агаровых блоков. Суспензию препарата с титром 1×10 6 КОЕ/см 3 вносили в мясо-пептонный агар, остуженный до температуры (36±1)°С. Для выращивания фитопатогенов использовали:
— среду Чапека для Didymella applanata;
картофельно-глюкозный агар для Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Alterneria alternaya, Fusarium moniliformes, Fusarium sporotrichiella, Rhizoctonia solani.
Инокулированную исследуемым штаммом среду разливали в чашки Петри и на застывшую поверхность, в центр помещали блок диаметром 10 мм, вырезанный из колонии фитопатогена.
Учет результатов проводили с периодичностью 1 раз в 3 дня. Активность штамма учитывали по изменению диаметра колонии гриба в сравнении с контролем (среда без внесения штамма). На основании полученных данных определяли ингибирующую активность, которую рассчитывали по формуле
,
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-831-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-832-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-833-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-834-1-2 на 7-е сутки:
Таким образом, заявляемые штаммы Bacillus licheniformis проявляют антагонистическую активность по отношению к выше перечисленным грибным фитопатогенам.
Пример 8. Данные полевых испытаний по изучению влияния препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 на пораженность малины пурпуровой пятнистостью и смородины септориозом
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 с целью определения наличия фунгицидной активности в отношении болезней малины и смородины в открытом грунте использовали промышленные посадки малины сорта Зоренька Алтая и смородины сорта Софья. В качестве химического эталона использовали препарат Топаз в концентрации 0,1%. Обработку проводили суспензией препаратов с титром 10 6 спор/мл.
Обработку посадок проводили в июле и июне. Сроки обработки определялись при появлении первых симптомов болезней.
Схема полевого опыта:
— штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2;
Поражение листьев смородины септориозом учитывали по следующей шкале:
Степень повреждения побегов малины оценивали по специальной 4-балльной шкале для пурпуровой пятнистости малины:
Развитие болезни определяли по следующей формуле:
Распространенность рассчитывали по формуле
где
Биологическую эффективность биопрепаратов определяли по формуле
Результаты полевых опытов представлены в таблицах.
Таблица 5. Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение малины пурпуровой пятнистостью. Вариант Распространенность, % Развитие, % Биологическая эффективность, % Контроль 75,0 25,0 — Штамм B. lich. IC 831-1-2 34,1 8,5 66,0 Штамм B. lich. IC-832-1-2 43,2 10,8 56,8 Штамм B. lich. IC 833-1-2 40,8 12,0 61,4 Штамм B. lich. IC 834-1-2 37,5 9,0 62,7 Топаз 0,1% 38,6 10,8 56,8 НСР05 4,0
Таблица 6. Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение малины пурпуровой пятнистостью. Вариант Распространенность, % Развитие, % Биологическая эффективность, % Контроль 95,0 35,0 — Штамм B. lich. IC 831-1-2 32,5 8,1 76,9 Штамм B. lich. IC-832-1-2 35,0 15,6 55,4 Штамм B. lich. IC 833-1-2 37,0 13,0 59,5 Штамм B. lich. 1С 834-1-2 44,0 11,2 75,9 Топаз 0,1% 50,0 12,5 64,3 НСР05 7,0
Таблица 7. Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение смородины септориозом. Вариант Биологическая эффективность, % Сроки учетов 27 июня 4 июля 11 июля B. licheniformis IC 831-1-2 80,6 61,3 54,8
Пример 9. Исследования заявляемого препарата в виде микробиологического удобрения
Таблица 8. Исследование препаратов в виде микробиологического удобрения. Вариант опыта Показательная группа почвенной микрофлоры, КОЕ/г Отклонение от контроля 1 Общее микробное число 1.1 Контроль 98,2×10 5 1.2 Обработка семян штаммом 163×10 5 64,8 Bacillus stearothermophilus IC-834-1-4 1.3 Обработка семян препаратом 132,1×10 5 33,9 Фитоп 1.4 Контроль 40,13×10 5 1.5 Подкормка вегетирующих 86×10 5 45,87 растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 1.6 Подкормка вегетирующих 32,07×10 5 8,06 растений препаратом Фитоп 2 Бактерии рода Bacillus 2.1 Контроль 11,3×10 4 2.2 Обработка семян штаммом 17,7×10 4 6,4 Bacillus stearothermophilus IC-834-1-4 2.3 Обработка семян препаратом 12,5×10 4 1,2 Фитоп 2.4 Контроль 13,5×10 4 2.5 Подкормка вегетирующих 23,1×10 4 9,6 растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 2.6 Подкормка вегетирующих 15,1×10 4 1,6 растений препаратом Фитоп 2.7 контроль 14,3×10 4 2.8 Обработка семян и подкормка 21,3×10 4 7 вегетирующих растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 2.9 Обработка семян и подкормка 16,7×10 4 2,4 вегетирующих растений
препаратом Фитоп 3 Истинные денитрификаторы 3.1 Контроль 33,5×10 5 3.2 Обработка семян штаммом Bacillus stearothermophilus IC-834-1-4 55,2×10 5 21,7 3.3 Обработка семян препаратом Фитоп 34,9×10 5 1,4 3.4 Контроль 36,6×10 5 3.5 Обработка семян и подкормка вегетирующих растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 58,1×10 5 21,5 3.6 Обработка семян и подкормка 27,3×10 5 9,3 вегетирующих растений препаратом Фитоп 4 Азотфиксирующие (аммонифицирующих) микроорганизмы 4.1 Контроль 37,5×10 5 4.2 Обработка семян штаммом Bacillus stearothermophilus IC-834-1-4 33,6×10 5 4.3 Обработка семян препаратом Фитоп 56,7×10 5 19,2 5 Автохтонная микрофлора 5.1 Контроль 3,8×10 4 5.2 Обработка семян штаммом Bacillus stearothermophilus IC-834-1-4 2,3×10 4 -1,5 5.3 Обработка семян препаратом Фитоп 6,3×10 4 2,5 5.4 Контроль 0,9×10 4 5.5 Подкормка вегетирующих 0,5×10 4 растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 5.6 Подкормка вегетирующих растений препаратом Фитоп 2,3×10 4 1,4 5.7 Контроль 3,9×10 4 5.8 Обработка семян и подкормка вегетирующих растений препаратом Фитоп 0,8×10 4 -3,1 5.9 Обработка семян и подкормка вегетирующих растений штаммом В. stearothermophilus IC-834-1-4 5,4×10 4 1,5
Пример 10. Данные по восстановлению микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных с использованием заявляемого препарата
Исследования связаны с определением динамики изменения количественного состава показательных групп кишечной микрофлоры в течение всего периода выведения штаммов из организма животных. Материалом для работы служили:
1. Здоровые беспородные мыши обоего пола из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Животных содержали при температуре (25±1)°С и 12-часовом освещении. В качестве корма использовали гранулы для кормления лабораторных мышей и крыс. Животных распределяли по следующим группам:
Каждая группа содержала по 5 животных.
2. В экспериментах использовались препараты в виде культуральной жидкости используемых штаммов титром не менее 1×10 8 KOE/мл. Препараты экспериментальным животным выпаивали по следующей схеме:
1. Для количественного учета динамики выделения штаммов использовали метод последовательного разведения фекалий животных с последующим высевом 100 мкл предварительно прогретой при 100°С в течение 10 минут суспензии из каждого разведения на мясо-пептонный агар в чашки Петри.
Таблица 9. Данные по восстановлению микрофлоры ЖКТ животных Дата, штамм E. coli Enterococcus Lactobacillus Патогенные, в том числе протей Bifidobacterium 1 2 4 5 6 7 0 день Контроль 7×10 4 1×10 4 3×10 6 10 3 10 8 7048 2,8×10 5 1×10 4 5,3×10 7 10 3 10 8 IC-831-1-4 5×10 5 1×10 4 7×10 6 10 3 10 8 IC-832-1-4 2×10 5 1×10 4 7×10 6 10 3 10 8 IC-833-1-4 1×10 5 1×10 4 1×10 6 10 3 10 8 IC-834-1-4 3×10 5 1×10 4 2,2×10 6 10 3 10 8 10 день Контроль 5×10 5 1,1×10 4 3,4×10 7 10 4 10 8 7048 2,2×10 7 1×10 5 3×10 7 10 3 10 8 IC-831-1-4 2,7×10 6 3×10 5 3,8×10 6 10 3 10 8 IC-832-1-4 2×10 7 2×10 6 5×10 7 10 3 10 8 IC-833-1-4 2,6×10 8 1×10 5 2,2×10 8 10 3 10 9 IC-834-1-4 1,8×10 7 3,7×10 6 2×10 7 10 3 10 9 20 день Контроль 1×10 5 1×10 4 1×10 5 10 4 10 8 7048 4×10 7 1×10 4 1×10 6 10 4 10 9 IC-831-1-4 1×10 7 1,2×10 7 3×10 8 10 2 10 9 IC-832-1-4 1×10 7 1×10 6 6×10 8 10 3 10 9 IC-833-1-4 2×10 8 5×10 7 1×10 8 10 2 10 9 IC-834-1-4 2×10 8 1×10 7 1×10 9 10 2 10 9 30 день Контроль 3×10 4 1,2×10 4 1,0×10 6 10 4 10 7 7048 7,7×10 7 5×10 7 1,5×10 8 10 4 10 9 IC-831-1-4 5×10 7 4,6×10 7 2,6×10 8 10 2 10 9 IC-832-1-4 3,6×10 8 5,1×10 7 3,9×10 9 10 2 10 10 IC-833-1-4 5×10 8 8×10 8 6×10 8 10 2 10 10 IC-834-1-4 2,0×10 8 4,6×10 8 2,0×10 9 10 2 10 10 40 день Контроль 1,0×10 5 6×10 4 3×10 5 10 4 10 8 7048 2,1×10 7 3×10 7 1×10 7 10 4 10 9 IC-831-1-4 7,5×10 7 2×10 7 1,3×10 9 10 2 10 9 IC-832-1-4 9,5×10 9 1×10 8 2×10 10 10 2 10 10 IC-833-1-4 6,3×10 8 3×10 9 6,2×10 9 10 2 10 10 IC-834-1-4 1×10 9 1×10 9 5×10 9 10 2 10 10 50 день
Контроль 2×10 5 2,4×10 4 6×10 6 10 4 10 8 7048 6×10 7 2,0×10 7 2×10 8 10 4 10 9 IC-831-1-4 1×10 8 2×10 8 1,5×10 9 10 2 10 9 IC-832-1-4 1,4×10 9 1,0×10 8 3×10 10 10 2 10 10 IC-833-1-4 2,0×10 8 3,9×10 10 1,0×10 10 0 10 11 IC-834-1-4 1×10 9 3×10 9 2,3×10 10 0 10 11
2. Для количественного учета динамики изменения кишечной микрофлоры ежедневно производили высевы из фекалий мышей всех опытных групп по стандартной схеме обследования на дисбактериоз, включающей:
— определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) с нормальной ферментативной активностью на среде Эндо и среде Левина;
— энтерококков на полимиксиновом агаре;
— лактобактерий на среде Бликфельдта;
— условно-патогенных микроорганизмов на среде Плоскирева и желточно-солевом агаре;
— бифидобактерий на тиогликолевой среде.
В таблице 9 приведены данные по восстановлению микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Анализ таблицы 9 показывает высокую эффективность восстановления кишечной микрофлоры животных по сравнению с контролем и коммерческим препаратом-пробиотиком Ветом 3 (штамм В. subtilis ВКПМ В 7048).
Показания к применению (рекомендательные). Препараты на основе штаммов Bacillus stearothermophilus IC-831-1-4, IC-833-1-4, IC-834-1-4 рекомендуется использовать для профилактики и лечения дисбактериозов сельскохозяйственных и диких птиц, в том числе кур, уток, гусей, индеек, цесарок и других, повышения естественной резистентности организма птиц, устранения иммунодефицитных состояний, вызванных инфекционными (вирусы, бактерии, простейшие, внутриклеточные) и неинфекционными (некачественные корма, скученное содержание, стресс вследствие несоблюдения температурных режимов содержания) факторами, увеличения сохранности поголовья, увеличение яйценоскости, получения дополнительных привесов бройлеров, снижения конверсии кормов, уменьшения времени выращивания птицы. Профилактики и лечения дисбактериозов всех видов продуктивных сельскохозяйственных животных, лечения инфекционных заболеваний бактериальной и протозойной этиологии, профилактики вирусных заболеваний и иммунодефицитных состояний, повышения сохранности молодняка в ранние периоды развития, повышения продуктивности, получения дополнительных привесов.
Препараты на основе штаммов Bacillus stearothermophilus IC-832-1-4 рекомендуется использовать для профилактики и лечения дисбактериозов крупного рогатого скота, лечения инфекционных заболеваний бактериальной и протозойной этиологии, профилактики вирусных заболеваний и иммунодефицитных (первичных и вторичных) состояний, повышения сохранности молодняка КРС в ранние периоды развития, повышения продуктивности молочного животноводства, получения дополнительных привесов молодняка мясного животноводства, улучшения качества и сортности молока и мяса, продления фертильности маточного поголовья.
1. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, обладающий
бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10561.
2. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-832-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10562.
3. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-833-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10563.
4. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-834-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10564.
5. Препарат, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, характеризующийся содержанием наполнителя с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, или ВКПМ В-10562, или ВКПМ В-10563, или ВКПМ В-10564, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г или 1·10 3 КОЕ/мл.
6. Препарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит воду.
7. Препарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит порошкообразный сорбент.
8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что в качестве порошкообразного сорбента он содержит цеолит, или полисахарид, или моносахарид, или дисахарид, или смесь полисахарида с моносахаридом или полисахаридом в соотношении от 1:100 до 1:10.
Сведения о бактерии:
Вид B.licheniformis относят к роду Bacillus, семейству Bacillaceae, порядку Bacillales, классу Firmicutes, царству Bacteria. (link)
Чем интересна B.licheniformis и зачем был секвенирован ее геном?
Bacillus licheniformis относится к разряду полезных почвенных бактерий, которые образуют гумус из животных и растительных остатков (является бактерией-сапрофитом, то есть извлекает питательные вещества из разлагающегося материала). При недостатке питания спорализуется, что делает ее устойчивой к нагреванию, охлаждению, высушиванию, воздействию радиации и позволяет выжить в неблагоприятных условиях. При улучшении условий споры прорастают.
Bacillus licheniformis выделена из почвы в экологически чистых районах Сибири. Дружественна организму любого млекопитающего.
Этот организм является близкородственным к Bacillus subtilis (исходя из типа рРНК).
Она выполняет роль дезинфектанта в почве, растениях, организме теплокровных и хладнокровных животных и человека. Именно это дало возможность растениям и животным приспособиться к жизни на Земле и занять свою экологическую нишу. Не будь этой и подобной ей бактерий высшие организмы погибли бы от инфекций, не успев сформироваться как вид.1
Различные штаммы Bacillus licheniformis входят в состав лекарственных препаратов. В отличие от антибиотиков, в качестве действующего начала в этих препаратах используются живые бактерии, поэтому в организме не убивается все живое, как в случае с антибиотиками. Препараты с живыми бактериями Bacillus licheniformis подавляют патогенную, условно-патогенную и гнилостную микрофлору и обеспечивают возможность роста и развития нормальной микрофлоры кишечника. Этот механизм сформировался за миллионы лет эволюции живого на нашей планете. Древние люди получали эту бактерию при контактировании с почвой, пылью и при съедании грязной пищи. В современных условиях эти способы поступления Bacillus licheniformis в организм человека утратили свое значение. Поэтому человеку приходится пополнять свои запасы этой бактерии посредством приема лекарственных препаратов.
Штамм бактерий bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и касается получения штаммов пробиотиков.
Известно, что аэробные спорообразующие бактерии характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных бактерий, что позволяет использовать их в составе пробиотиков. Среди пробиотиков, широко применяемых в медицинской и ветеринарной практике, все большее распространение получают препараты, основой которых являются бактерии рода Bacillus.
Известен бактериальный штамм Bacillus licheniformis 31 [7], характеризующийся антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно патогенных бактерий и являющийся факультативным аэробом. Благодаря этому он способен расти и проявлять антимикробные свойства в условиях с пониженным содержанием кислорода, но не обладает выраженной антивирусной активностью.
Поставленная задача решается путем трансформации штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pBMB 105, кодирующей синтез альфа-2-интерферона человека.
Получение компетентных клеток и трансформацию плазмидной ДНК проводят известным методом [3]. Трансформанты высевают на чашки с селективной средой, содержащей канамицин (10 мкг/мл) и выращивают при 37 o C 24 часа. Сконструированный штамм Bacillus licheniformis 2336/105 характеризуется следующими признаками: Морфологические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях, не гидролизует мочевину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Растет в присутствии 10% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. При росте на МПБ образует аммиак, не образует сероводород и индол. Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитиназной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона и выражают в международных единицах (ME).
Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что образцы культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis 2336/105 при выращивании в микроаэрофильных условиях обладают антивирусной активностью в отличие от штаммов-аналогов.
Сконструированный штамм характеризуется также высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, как и исходная культура Bacillus licheniformis 31 (табл. 2).
Безвредность нового штамма Bacillus licheniformis изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (результаты представлены в таблице 3.1. ), вирулентность (табл. 3.2), токсичность (табл. 3.3) в сравнении с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.
Введение суспензии живых клеток 24-часовой культуры перорально в дозах 1-10 млрд. микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 млрд. микробных клеток/на мышь не вызывает у животных каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявляет у них патологических изменений, регистрируемых микроскопически.
Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма Bacillus licheniformis 2336/105 на мясо-пептонном бульоне) не выявляет у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.
Таким образом, полученные данные дают основание отнести сконструированный штамм к 4-му классу по классификации, приведенной в методических указаниях МЗ СССР, главного санитарно-эпидемиологического управления «Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов и на их основе готовых форм препаратов. «, /М., 1983/, т.е. к микроорганизмам, практически не обладающим аллергенным и общетоксическим действием.
Стабильность рекомбинантной плазмиды pBMB 105 в штамме Bacillus licheniformis 2336/105 определяют следующим образом: клетки Bacillus licheniformis 2336/105 выращивают в 5 мл среды 2xLB с крахмалом до стационарной фазы; затем 0,5 мл выросшей культуры переносят в 4,5 мл свежей среды 2xLB и вновь выращивают до стационарной фазы; проводят 5 пересевов, причем после каждого пересева проводят высев на МПА без антибиотика. Выросшие изолированные колонии перекапывают на чашки с МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр. После подкрашивания подсчитывают и сравнивают число колоний, выросших на МПА с антибиотиком и без антибиотика. Таким образом определяют количество клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду после каждого пересева. Отсутствие плазмиды подтверждают методом выделения плазмидной ДНК.
Сохранность гена интерферона человека типа альфа-2 в рекомбинантной плазмиде pBMB 105 после пересевов подтверждают методом гибридизации: нитроцеллюлозные фильтры с отпечатками колоний после пересевов инкубируют с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона альфа-2, выделенным из плазмиды pBMB 105. Все клоны, не потерявшие рекомбинантные плазмиды после пересевов, гибридизуются с меченым фрагментом, что свидетельствует о сохранности гена интерферона в составе плазмиды pBMB 105. Кроме того, из случайно отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью эндонуклеаз рестрикции. В результате описанных экспериментов установлено, что рекомбинантная плазмидная ДНК рBMB 105 сохраняется и наследуется в течение 5 пересевов на МПА без селективного давления.
Таким образом, впервые получен штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью в микроаэрофильных условиях, который может служить основой для создания препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекционных заболеваний смешанной этиологии у животных и человека.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения: Пример 1. Получение штамма Bacillus licheniformis 2336/105. Трансформацию штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pMB 105 проводили стандартным методом [3]. Для выделения плазмид из штаммов бацилл известная методика [9] была модифицирована. Изменения были введены на основании экспериментов по изучению влияния различных составов лизирующих буферов и времени обработки клеток бацилл для достижения более полного лизиса и максимального выхода плазмидной ДНК. Период инкубации с лизоцимом был увеличен с 20 мин до 40 мин.
Пример 2. Определение антивирусной активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Для определения антивирусной активности штамма, детерминируемой интерфероном, готовят опытные образцы культуральной жидкости.
Для сравнения и в качестве контроля используют штаммы-аналоги: родительский Bacillus licheniformis 31 и рекомбинантный Bacillus subtilis ВКПМ-475.
Пример 3. Определение антагонистической активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Антагонистическую активность исследуют методом радиальных штрихов [4]. 18-часовую культуру Bacillus licheniformis 2336/105 высевают в центр чашки диаметром 12 см на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 суток инкубирования при 28 o C подсевают по радиальным штрихам тест-культуры на бактериальной суспензии 5 х 10 кл/мл. Зоны отсутствия роста учитывают через 18-24 часа инкубирования. Контролем служат чашки без культуры B.licheniformis.
результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о сохранении антагонистических свойств у рекомбинантного штамма по сравнению с исходным родительским штаммом.
Пример 4. Изучение безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.
Безвредность штамма изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (табл. 3.1), вирулентность (табл. 3.2.), токсичность (табл. 3.3), сравнивая с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.
Наблюдения за животными проводят на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или перорального введения. В период наблюдений все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и контрольные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты микроскопическому изучению.
Результаты экспериментов свидетельствуют о безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105 для теплокровных.
Литература:
1. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал, 1993, Т. 55, N 4 с. 92-112.
2. Патент РФ 1839459, кл. C 12 N 1/21, 1990 г.
5. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал 1992, Т. 54, N 6, с. 82-94.
6. А.с.СССР 1722502, кл. A 61 K 39/02, 1989г.
9. Бациллы. Генетика и биотехнология. //Под редакцией К.Харвуда, М., «Мир», 1992, с. 460.
Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью.
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью «Диафарм»
Договор № РД0068088 зарегистрирован 05.08.2010
PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)
Адрес для переписки:
630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н., р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Пробиотики
Слово «пробиотик» вошло в обиход фармацевтов, врачей и технологов пищевых производств не так давно — в конце 70-х годов 20 века. Оно образовано от латинских корней pro + bio, что дословно значит «для жизни». Пробиотиками называют полезные для человека и животных микроорганизмы (как правило, бактерии, реже — дрожжевые грибки), составляющие микрофлору здорового кишечника.
В случае стрессов, болезней и лечения сильнодействующими препаратами, количество микроскопических «жителей» сокращается, что приводит к развитию патогенной среды — благоприятной для вирусов и микробов. Восстановить равновесие можно, приняв «помощников» внутрь. Чаще всего для этого используются различные штаммы лактобацилл и бифидобактерий, а также энтерококки, спорообразующие аэробные бактерии и другие бактерии или их смеси.
В последнее время пробиотики стали добавлять не только в продукты для людей, но и готовые корма для собак и кошек. Конечно, если питомцы страдают от серьёзных кишечных расстройств и эндокринных заболеваний, дозы пробиотиков в корме будет мало — для улучшения здоровья потребуются специальные препараты. Однако такая добавка будет нелишней для профилактики кишечных нарушений и укрепления иммунитета здоровых животных.
Разумеется, больше доверия вызывают ингредиенты с максимально полной информацией, поэтому ответственный производитель обязательно укажет, какие именно микроорганизмы или их сочетание он добавил в формулу корма и в каком количестве. Бактерии принято исчислять в КОЕ (колониеобразующих единицах), или в международном обозначении на латинице — CFU.
В идеале, после них должен ещё прописываться специальный код из латинских букв и цифр, который маркирует выращенную в лаборатории колонию микроорганизмов. Некоторые производители дополнительно сообщают о том, в какой форме ими были задействованы пробиотики (в жидкой или сухой). Если же в составе корма, кроме общего названия, нет никаких данных о «пробиотиках», трудно поручиться, что такой ингредиент принесёт пользу организму питомца.
Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма
Владельцы патента RU 2440413:
Изобретение относится штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающего антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на их основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений. Штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 получены методом направленной селекции и депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационными номерами ВКПМ соответственно: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. Препарат характеризуется содержанием наполнителя с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, или ВКПМ В-10562, или ВКПМ В-10563, или ВКПМ В-10564, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г или 1·10 3 КОЕ/мл. В качестве наполнителя он содержит воду или порошкообразный сорбент. Изобретение позволяет повысить эффективность восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширить спектр антибактериальной и фунгицидной активности. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 табл.
Изобретение относится к штамму микроорганизма, обеспечивающему восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных, обладающему антибактериальной и фунгицидной активностью, и к препаративной форме на его основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине и защите растений для получения препаратов против бактериальных и грибных инфекций животных и растений, а также для использования в качестве микробиологических удобрений и пробиотиков для восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Препарат Фитоспорин-М (порошок на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень), бобовых (горох), овощных культур (картофель, капуста, томаты, огурцы), (патент РФ №2129375, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 27.04.1999 г.).
Препарат Бактофит (смачивающийся порошок на основе штамма ИПМ 215 Bacillus subtilis) предназначен для защиты от болезней овощных и цветочных культур, выращиваемых в открытом и защищенном грунте, а также черной смородины от мучнистой росы.
Среди микробиологических удобрений аналогом заявляемого препарата является препарат Бактофосфин, основу которого составляют почвенные микроорганизмы Bacillus mucilaginosus, предназначенный для обогащения почвы усвояемыми растениями формами фосфора, а также восстановления ее плодородия, повышения всхожести и урожайности многих видов сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте. Авторами данного удобрения не приводятся конкретные данные по влиянию на показательные для плодородных почв группы микроорганизмов, а также влияния на урожайность культур.
Микробиологическое удобрение Байкал Эм-1 содержит консорциум представителей различных групп микроорганизмов, в том числе грибов, которые, развиваясь в почве при внесении как симбиотическое сообщество, призваны увеличить численность почвенной микрофлоры и, соответственно, плодородие и урожайность.
Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибковых возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при хранении (Авторское свидетельство СССР №1706504, кл. А01N 63/00, 1992 г.) [2].
Однако данный штамм также оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7036, предназначенный для получения препарата против грибных болезней растений (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.). Штамм подвергался селекции на подавление бактериального роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: Phytophthore infestans, Microsporium solani, Fusarium solani (возбудитель сухой гнили).
Однако штамм-прототип и препарат на его основе обладают недостаточно широким спектром антагонистической активности, а также не исследовался на способность восстановления микробиоценоза ЖКТ животных.
Техническим результатом заявляемых технических решений является обеспечение восстановления микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширение спектра антибактериальной и фунгицидной активности.
Указанный технический результат достигается путем получения методом направленной селекции четырех вариантов бактериальных штаммов Bacillus licheniformis: IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2, обеспечивающих восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающих бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированых от 18.03.2010 г. во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика соответственно под №ВКПМ: В-10561, В-10562, В-10563 и В-10564. (справки о депонировании прилагаются).
Исходные клоны для получения заявляемых штаммов были выделены из здоровых животных в экологически чистом районе Новосибирской области (Завьяловский бор):
— штамм Bacillus licheniformis: IC-831-1-2 выделен из фекалий гуся,
— штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2 выделен из фекалий коровы,
— штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2 выделен из фекалий гуся,
— штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2 выделен из фекалий курицы.
Исходные клоны подвергались селекции на подавление бактериального и грибного роста. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода Candida, возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины.
Иммобилизация спор бактерий на крахмале обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает агрегирование спор и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.
При применении препарата крахмал способствует ускорению прорастания спор бактерий, что повышает эффективность его действия.
Кроме того, использование заявляемых компонентов препарата значительно упрощает технологию его получения как на этапах культивирования (в технологии отсутствует использование дорогих ферментов, не требуется очистка и концентрирование препарата), так и на этапах получения его готовой формы (удаление и перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата).
Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Штаммы относятся к грамположительным факультативно анаэробным палочковидным бактериям. При росте на мясо-пептонном агаре дают морщинистую форму колоний с обильным образованием слизи и выделением розовато-красного пигмента в верхний слой среды под колонией. Колонии кремово-розовые. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки (1,09-1,96) мкм, ширина (0,36-0,97) мкм. Капсулу не образуют, выделяют большое количество слизи. По Граму окрашиваются положительно. Штаммы являются термофильными, размножаются при (35-65)°С, оптимальный рост при температуре (37-40)°С.
Через 48 часов роста при 40°С на мясо-пептонном агаре культуры имеют непрозрачные колонии неоднородной консистенции, со слизистыми включениями и волнистым краем, вросшие в поверхность агаровой пластинки. pH среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 6,5-7,0. Штаммы размножаются при 40°С на мясо-пептонном агаре и мясо-пептонном бульоне.
Биохимические свойства штаммов. Они не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Не обладают лецитиназной активностью. Обладают каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне (1-9) %.
Штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.
Штаммы продуцируют биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры.
При длительном хранении штаммов споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерий используют мясо-пептонный бульон, культивирование проводят при температуре 40°С.
Пример 1. Исследование непатогенности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2.
Исследование проведено в лаборатории биотехнологического контроля НПФ «Исследовательский центр».
Патогенность каждого микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, их внешнему виду и поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.
В работе использованы лабораторные животные двух видов: нелинейные белые мыши массой (18-20) г в количестве 40 особей обоего пола и крысы породы Вистар массой (180-200) г в количестве 40 особей обоего пола. Из животных формировали опытную и контрольную группу по 20 особей в каждой. Для выявления проникновения бактерий в органы экспериментальных животных животным из опытных групп на протяжении 60 суток перорально вводили суточную культуральную жидкость бактерий, полученную путем культивирования исследуемого штамма на мясо-пептонном бульоне.
Животных из опытных и контрольных групп забивали по следующей схеме:
После проведения вскрытия посевы из органов (сердце, легкое, печень, селезенка) и крови производили на мясо-пептонный и кровяной агары в чашки Петри методом отпечатков. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24 часов. Результаты учитывали по наличию/отсутствию колоний на поверхности питательной среды в чашке Петри.
В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов во все периоды проведения вскрытий патологических изменений не обнаружено.
Микробиологический анализ показал, что внутренние органы и кровь были стерильными в опытном и контрольном вариантах во все периоды проведения исследований.
На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении, на протяжении 60-дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа сердца, легких, печени, селезенки и крови сделан вывод, что штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 являются непатогенными.
Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Полученные путем селекции штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяли методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp.
Используемые тест-штаммы удовлетворяли следующим требованиям: находились в S-форме, имели типичные морфологические и ферментативные свойства.
Исследование антагонистической активности заявляемых штаммов Bacillus licheniformis производили на мясо-пептонном агаре.
Рецептура мясо-пептонного агара на 1 дм 3 :
Учет результатов проводили через 8 часов инкубирования при (37±1)°С по величине зон угнетения роста тест-штаммов. Контролем роста культур патогенов служил их параллельный высев на чашки Петри с той же плотной средой (мясо-пептонным агаром), но без исследуемой ассоциации антагониста. В результате проведенных исследований установлено, что штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 1).
| Таблица 1. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-831-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1126-4-1 | 13 |
| Staphylococcus aureus IC-1142-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1192-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1200-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus IC-1246-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus IC-1120-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1128-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1257-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1249-4-1 | 13 |
| Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1149-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus IC-1251-4-1 | 23 |
| Staphylococcus aureus IC-1226-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1230-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1140-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus IC-1222-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1165-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus IC-1205-4-1 | 17 |
| Staphylococcus haemoliticus IC-1256-4-2 | 20 |
| Staphylococcus aureus IC-1232-4-1 | 14 |
| Staphylococcus aureus IC-1167-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1131-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1259-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1243-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus IC-1231-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus IC-1233-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus IC-1234-4-1 | 10 |
| Staphylococcus haemoliticus IC-1258-4-2 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 11 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 13 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Продолжение таблицы 1 | |
| Candida albicans IC-53-9-1 | 12 |
| Candida albicans IC-1147-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1150-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1203-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1195-9-1 | 10 |
| Candida krusei IC-1244-9-2 | 15 |
| Candida albicans IC-1144-9-1 | 15 |
| Candida albicans IC-1132-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1130-9-1 | 20 |
| Candida albicans IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-26-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans IC-55-9-1 | 11 |
| Candida albicans IC-1119-9-1 | 9 |
| Candida albicans IC-1240-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1166-9-1 | 10 |
| Candida albicans IC-1137-9-1 | 14 |
| Candida albicans IC-1186-9-1 | 10 |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-27-10-1 | 6 |
| Shigella flexneri IC-815-14-2 | 7 |
| Shigella sonnei IC-47-14-1 | 5 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45- | |
| 13-1 | 8 |
| Serratia marcescens IC-1170-17 | 12 |
| Escherichia coli IC-1184-5-1 | 10 |
| Escherichia coli IC-1273-5-1 | 8 |
| Escherichia coli IC-1429-5-1 | 3 |
| Escherichia coli IC-1427-5-1 | 30 |
| Escherichia coli IC-1151-5-1 | 7 |
| Enterococcus spp. IC-1236-16 | 15 |
| Enterococcus faecium IC-1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. IC-1163-16 | 15 |
| Enterococcus spp. IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. IC-1423-16 | 10 |
| Enterococcus spp. IC-1168-16 | 10 |
| Enterococcus spp. IC-1175-16 | 12 |
Штамм В. licheniformis IC-832-1-4 характеризуется следующими показателями зон (мм) задержки роста тест-штаммов патогенов (таблица 2).
| Таблица 2. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-832-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1136-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 20 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 18 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-26-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1186-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Pseudomonas aeruginosa штамм IC-1210-7-1 | 12 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 7 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 30 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 0 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 24 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 25 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 23 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 24 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 | 12 |
| Продолжение табл.2 | |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 11 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 12 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 11 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 30 |
Штамм B. licheniformis IC-833-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 3).
| Таблица 3. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-833-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 8 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 6 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1133-9-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-26-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1139-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1240-9-1 | 10 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 30 |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-43-10-1 | 6 |
| Продолжение табл.3 | |
| Klebsiella pneumonia штамм IC-31-10-1 | 9 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 12 |
| Shigella sonnei штамм IC-1216-14-1 | 30 |
| Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 | 30 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-25-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 26 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 | 8 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1258-4-2 | 5 |
| Staphylococcus aureus штамм IС-1230-4-1 | 12 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 24 |
| Staphylococcus haemoliticus штамм IC-1256-4-2 | 9 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 16 |
| Escherichia coli штамм IC-1153-5-1 | 8 |
| Escherichia coli штамм IC-34-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1148-5-1 | 7 |
| Escherichia coli штамм IC-36-5-1 | 6 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 20 |
| Escherichia coli штамм IC-1151-5-1 | 6 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 16 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1423-16 | 8 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 | 8 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 | 10 |
Штамм B. licheniformis IC-834-1-2 характеризуется следующими показателями зон задержки роста (мм) тест-штаммов патогенов (таблица 4).
| Таблица 4. | |
| Характеристика штамма B. licheniformis IC-834-1-2 по показателям зон задержки роста тест-штаммов патогенов | |
| Наименование тест-штамма | Размер зоны (мм) |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1161-4-1 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1124-9-1 | 18 |
| Candida albicans штамм IC-1172-9-1 | 9 |
| Candida albicans штамм IC-1152-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1155-9-1 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1143-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1141-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1134-9-1 | 30 |
| Escherichia coli штамм IC-1250-5-1 | 5 |
| Shigella flexneri штамм IC-815-14-2 | 9 |
| Candida albicans штамм IC-53-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1147-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1203-9-1 | 15 |
| Salmonella enteritidis штамм IC-1159-6-1 | 5 |
| Candida albicans штамм IC-1136-9-1 | 7 |
| Candida albicans штамм IC-1195-9-1 | 10 |
| Candida krusei штамм IC-1244-9-2 | 14 |
| Candida albicans штамм IC-1144-9-1 | 15 |
| Candida albicans штамм IC-1132-9-1 | 12 |
| Candida albicans штамм IC-1130-9-1 | 13 |
| Candida albicans штамм IC-1156-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1122-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1150-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-55-9-1 | 30 |
| Candida albicans штамм IC-1119-9-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1189-4-1 | 20 |
| Serratia marcescens штамм IC-817-17-1 | 16 |
| Yersinia pseudotuberculosis штамм IC-45-13-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1126-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1142-4-1 | 17 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1192-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1200-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1246-4-1 | 15 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1120-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1128-4-1 | 16 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1257-4-1 | 15 |
| Escherichia штамм coli IC-1153-5-1 | 10 |
| Продолжение табл.4 | |
| Escherichia штамм coli IC-1184-5-1 | 5 |
| Escherichia штамм coli IC-1273-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1193-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1116-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1424-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-1238-5-1 | 5 |
| Escherichia coli штамм IC-36-5-1 | 7 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1163-16 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1249-4-1 | 19 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1236-16 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1149-4-1 | 8 |
| Escherichia coli штамм IC-1430-5-1 | 7 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1251-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1226-4-1 | 10 |
| Escherichia coli штамм IC-1427-5-1 | 30 |
| Enterococcus faecium штамм IC 1253-16-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1140-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1222-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1165-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1205-4-1 | 18 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1256-4-2 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1133-9-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1241-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1230-4-1 | 30 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1164-16 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1232-4-1 | 20 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1167-4-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1131-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1259-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1243-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1179-4-1 | 9 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1125-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1274-4-1 | 30 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1231-4-1 | 20 |
| Candida albicans штамм IC-1154-9-1 | 22 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1229-4-1 | 8 |
| Candida albicans штамм IC-1202-9-1 | 6 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1233-4-1 | 8 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1234-4-1 | 10 |
| Staphylococcus aureus штамм IC-1258-4-2 | 8 |
| Enterococcus app. штамм IC-1423-16 | 10 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1168-16 | 10 |
| Enterococcus spp. штамм IC-1175-16 | 12 |
Таким образом, исследуемые штаммы бактерий проявляют антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Пример 3. Методика культивирования бактерий Bacillus licheniformis для получения микробной биомассы
Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:
Пример 4. Получение готовой формы препарата на основе бактерий штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Остаточная влажность препарата составляет не более 5%.
Пример 5. Составы препаратов
Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·10 3 КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с цеолитом с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:100.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-832-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-833-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:50.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-834-1-2 с титром спор не менее 1·10 6 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.
Смесь биомассы спор бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2, IC-834-1-2 в соотношении 1:1:1:1 с титром спор каждого вида бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе глюкозы в соотношении 1:20.
Пример 6. Данные по хранению сухой формы препарата на основе штаммов B. licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2
Для установления срока годности и условий хранения препарата проведены соответствующие исследования.
В течение 48 месяцев хранения сухой формы препарата при температуре (30±0,5)°С титр и антагонистическая активность препарата не изменились, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в ветеринарной медицине и растениеводстве.
Пример 7. Данные по ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении фитопатогенов.
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 в отношении способности ингибировать фитопатогенов использовали метод агаровых блоков. Суспензию препарата с титром 1×10 6 КОЕ/см 3 вносили в мясо-пептонный агар, остуженный до температуры (36±1)°С. Для выращивания фитопатогенов использовали:
— среду Чапека для Didymella applanata;
картофельно-глюкозный агар для Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Alterneria alternaya, Fusarium moniliformes, Fusarium sporotrichiella, Rhizoctonia solani.
Инокулированную исследуемым штаммом среду разливали в чашки Петри и на застывшую поверхность, в центр помещали блок диаметром 10 мм, вырезанный из колонии фитопатогена.
Учет результатов проводили с периодичностью 1 раз в 3 дня. Активность штамма учитывали по изменению диаметра колонии гриба в сравнении с контролем (среда без внесения штамма). На основании полученных данных определяли ингибирующую активность, которую рассчитывали по формуле
,
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-831-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штаммов Bacillus licheniformis IC-832-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-833-1-2 на 7-е сутки:
В результате исследований установлены следующие показатели ингибирующей активности штамма Bacillus licheniformis IC-834-1-2 на 7-е сутки:
Таким образом, заявляемые штаммы Bacillus licheniformis проявляют антагонистическую активность по отношению к выше перечисленным грибным фитопатогенам.
Пример 8. Данные полевых испытаний по изучению влияния препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 на пораженность малины пурпуровой пятнистостью и смородины септориозом
Для испытания штаммов Bacillus licheniformis IC-831-1-2, IC-832-1-2, IC-833-1-2 и IC-834-1-2 с целью определения наличия фунгицидной активности в отношении болезней малины и смородины в открытом грунте использовали промышленные посадки малины сорта Зоренька Алтая и смородины сорта Софья. В качестве химического эталона использовали препарат Топаз в концентрации 0,1%. Обработку проводили суспензией препаратов с титром 10 6 спор/мл.
Обработку посадок проводили в июле и июне. Сроки обработки определялись при появлении первых симптомов болезней.
Схема полевого опыта:
— штамм Bacillus licheniformis IC-831-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-832-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-833-1-2;
— штамм Bacillus licheniformis IC-834-1-2;
Поражение листьев смородины септориозом учитывали по следующей шкале:
Степень повреждения побегов малины оценивали по специальной 4-балльной шкале для пурпуровой пятнистости малины:
Развитие болезни определяли по следующей формуле:
Распространенность рассчитывали по формуле
где
Биологическую эффективность биопрепаратов определяли по формуле
Результаты полевых опытов представлены в таблицах.
| Таблица 5. | |||
| Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение малины пурпуровой пятнистостью. | |||
| Вариант | Распространенность, % | Развитие, % | Биологическая эффективность, % |
| Контроль | 75,0 | 25,0 | — |
| Штамм B. lich. IC 831-1-2 | 34,1 | 8,5 | 66,0 |
| Штамм B. lich. IC-832-1-2 | 43,2 | 10,8 | 56,8 |
| Штамм B. lich. IC 833-1-2 | 40,8 | 12,0 | 61,4 |
| Штамм B. lich. IC 834-1-2 | 37,5 | 9,0 | 62,7 |
| Топаз 0,1% | 38,6 | 10,8 | 56,8 |
| НСР05 | 4,0 |
| Таблица 6. | |||
| Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение малины пурпуровой пятнистостью. | |||
| Вариант | Распространенность, % | Развитие, % | Биологическая эффективность, % |
| Контроль | 95,0 | 35,0 | — |
| Штамм B. lich. IC 831-1-2 | 32,5 | 8,1 | 76,9 |
| Штамм B. lich. IC-832-1-2 | 35,0 | 15,6 | 55,4 |
| Штамм B. lich. IC 833-1-2 | 37,0 | 13,0 | 59,5 |
| Штамм B. lich. 1С 834-1-2 | 44,0 | 11,2 | 75,9 |
| Топаз 0,1% | 50,0 | 12,5 | 64,3 |
| НСР05 | 7,0 |
| Таблица 7. | |||
| Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов Bacillus licheniformis на поражение смородины септориозом. | |||
| Вариант | Биологическая эффективность, % | ||
| Сроки учетов | |||
| 27 июня | 4 июля | 11 июля | |
| B. licheniformis IC 831-1-2 | 80,6 | 61,3 | 54,8 |
Пример 9. Исследования заявляемого препарата в виде микробиологического удобрения
| Таблица 8. | |||
| Исследование препаратов в виде микробиологического удобрения. | |||
| Вариант опыта | Показательная группа почвенной микрофлоры, КОЕ/г | Отклонение от контроля | |
| 1 | Общее микробное число | ||
| 1.1 | Контроль | 98,2×10 5 | |
| 1.2 | Обработка семян штаммом | 163×10 5 | 64,8 |
| Bacillus stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 1.3 | Обработка семян препаратом | 132,1×10 5 | 33,9 |
| Фитоп | |||
| 1.4 | Контроль | 40,13×10 5 | |
| 1.5 | Подкормка вегетирующих | 86×10 5 | 45,87 |
| растений штаммом В. | |||
| stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 1.6 | Подкормка вегетирующих | 32,07×10 5 | 8,06 |
| растений препаратом Фитоп | |||
| 2 | Бактерии рода Bacillus | ||
| 2.1 | Контроль | 11,3×10 4 | |
| 2.2 | Обработка семян штаммом | 17,7×10 4 | 6,4 |
| Bacillus stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 2.3 | Обработка семян препаратом | 12,5×10 4 | 1,2 |
| Фитоп | |||
| 2.4 | Контроль | 13,5×10 4 | |
| 2.5 | Подкормка вегетирующих | 23,1×10 4 | 9,6 |
| растений штаммом В. | |||
| stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 2.6 | Подкормка вегетирующих | 15,1×10 4 | 1,6 |
| растений препаратом Фитоп | |||
| 2.7 | контроль | 14,3×10 4 | |
| 2.8 | Обработка семян и подкормка | 21,3×10 4 | 7 |
| вегетирующих растений | |||
| штаммом В. stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 2.9 | Обработка семян и подкормка | 16,7×10 4 | 2,4 |
| вегетирующих растений |
| препаратом Фитоп | |||
| 3 | Истинные денитрификаторы | ||
| 3.1 | Контроль | 33,5×10 5 | |
| 3.2 | Обработка семян штаммом | ||
| Bacillus stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | 55,2×10 5 | 21,7 | |
| 3.3 | Обработка семян препаратом | ||
| Фитоп | 34,9×10 5 | 1,4 | |
| 3.4 | Контроль | 36,6×10 5 | |
| 3.5 | Обработка семян и подкормка | ||
| вегетирующих растений | |||
| штаммом В. stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | 58,1×10 5 | 21,5 | |
| 3.6 | Обработка семян и подкормка | 27,3×10 5 | 9,3 |
| вегетирующих растений | |||
| препаратом Фитоп | |||
| 4 | Азотфиксирующие (аммонифицирующих) микроорганизмы | ||
| 4.1 | Контроль | 37,5×10 5 | |
| 4.2 | Обработка семян штаммом | ||
| Bacillus stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | 33,6×10 5 | ||
| 4.3 | Обработка семян препаратом | ||
| Фитоп | 56,7×10 5 | 19,2 | |
| 5 | Автохтонная микрофлора | ||
| 5.1 | Контроль | 3,8×10 4 | |
| 5.2 | Обработка семян штаммом | ||
| Bacillus stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | 2,3×10 4 | -1,5 | |
| 5.3 | Обработка семян препаратом | ||
| Фитоп | 6,3×10 4 | 2,5 | |
| 5.4 | Контроль | 0,9×10 4 | |
| 5.5 | Подкормка вегетирующих | 0,5×10 4 | |
| растений штаммом В. | |||
| stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | |||
| 5.6 | Подкормка вегетирующих | ||
| растений препаратом Фитоп | 2,3×10 4 | 1,4 | |
| 5.7 | Контроль | 3,9×10 4 | |
| 5.8 | Обработка семян и подкормка | ||
| вегетирующих растений | |||
| препаратом Фитоп | 0,8×10 4 | -3,1 | |
| 5.9 | Обработка семян и подкормка | ||
| вегетирующих растений | |||
| штаммом В. stearothermophilus | |||
| IC-834-1-4 | 5,4×10 4 | 1,5 |
Пример 10. Данные по восстановлению микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных с использованием заявляемого препарата
Исследования связаны с определением динамики изменения количественного состава показательных групп кишечной микрофлоры в течение всего периода выведения штаммов из организма животных. Материалом для работы служили:
1. Здоровые беспородные мыши обоего пола из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Животных содержали при температуре (25±1)°С и 12-часовом освещении. В качестве корма использовали гранулы для кормления лабораторных мышей и крыс. Животных распределяли по следующим группам:
Каждая группа содержала по 5 животных.
2. В экспериментах использовались препараты в виде культуральной жидкости используемых штаммов титром не менее 1×10 8 KOE/мл. Препараты экспериментальным животным выпаивали по следующей схеме:
1. Для количественного учета динамики выделения штаммов использовали метод последовательного разведения фекалий животных с последующим высевом 100 мкл предварительно прогретой при 100°С в течение 10 минут суспензии из каждого разведения на мясо-пептонный агар в чашки Петри.
| Таблица 9. | |||||
| Данные по восстановлению микрофлоры ЖКТ животных | |||||
| Дата, штамм | E. coli | Enterococcus | Lactobacillus | Патогенные, в том числе протей | Bifidobacterium |
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 0 день | |||||
| Контроль | 7×10 4 | 1×10 4 | 3×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| 7048 | 2,8×10 5 | 1×10 4 | 5,3×10 7 | 10 3 | 10 8 |
| IC-831-1-4 | 5×10 5 | 1×10 4 | 7×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| IC-832-1-4 | 2×10 5 | 1×10 4 | 7×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| IC-833-1-4 | 1×10 5 | 1×10 4 | 1×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| IC-834-1-4 | 3×10 5 | 1×10 4 | 2,2×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| 10 день | |||||
| Контроль | 5×10 5 | 1,1×10 4 | 3,4×10 7 | 10 4 | 10 8 |
| 7048 | 2,2×10 7 | 1×10 5 | 3×10 7 | 10 3 | 10 8 |
| IC-831-1-4 | 2,7×10 6 | 3×10 5 | 3,8×10 6 | 10 3 | 10 8 |
| IC-832-1-4 | 2×10 7 | 2×10 6 | 5×10 7 | 10 3 | 10 8 |
| IC-833-1-4 | 2,6×10 8 | 1×10 5 | 2,2×10 8 | 10 3 | 10 9 |
| IC-834-1-4 | 1,8×10 7 | 3,7×10 6 | 2×10 7 | 10 3 | 10 9 |
| 20 день | |||||
| Контроль | 1×10 5 | 1×10 4 | 1×10 5 | 10 4 | 10 8 |
| 7048 | 4×10 7 | 1×10 4 | 1×10 6 | 10 4 | 10 9 |
| IC-831-1-4 | 1×10 7 | 1,2×10 7 | 3×10 8 | 10 2 | 10 9 |
| IC-832-1-4 | 1×10 7 | 1×10 6 | 6×10 8 | 10 3 | 10 9 |
| IC-833-1-4 | 2×10 8 | 5×10 7 | 1×10 8 | 10 2 | 10 9 |
| IC-834-1-4 | 2×10 8 | 1×10 7 | 1×10 9 | 10 2 | 10 9 |
| 30 день | |||||
| Контроль | 3×10 4 | 1,2×10 4 | 1,0×10 6 | 10 4 | 10 7 |
| 7048 | 7,7×10 7 | 5×10 7 | 1,5×10 8 | 10 4 | 10 9 |
| IC-831-1-4 | 5×10 7 | 4,6×10 7 | 2,6×10 8 | 10 2 | 10 9 |
| IC-832-1-4 | 3,6×10 8 | 5,1×10 7 | 3,9×10 9 | 10 2 | 10 10 |
| IC-833-1-4 | 5×10 8 | 8×10 8 | 6×10 8 | 10 2 | 10 10 |
| IC-834-1-4 | 2,0×10 8 | 4,6×10 8 | 2,0×10 9 | 10 2 | 10 10 |
| 40 день | |||||
| Контроль | 1,0×10 5 | 6×10 4 | 3×10 5 | 10 4 | 10 8 |
| 7048 | 2,1×10 7 | 3×10 7 | 1×10 7 | 10 4 | 10 9 |
| IC-831-1-4 | 7,5×10 7 | 2×10 7 | 1,3×10 9 | 10 2 | 10 9 |
| IC-832-1-4 | 9,5×10 9 | 1×10 8 | 2×10 10 | 10 2 | 10 10 |
| IC-833-1-4 | 6,3×10 8 | 3×10 9 | 6,2×10 9 | 10 2 | 10 10 |
| IC-834-1-4 | 1×10 9 | 1×10 9 | 5×10 9 | 10 2 | 10 10 |
| 50 день |
| Контроль | 2×10 5 | 2,4×10 4 | 6×10 6 | 10 4 | 10 8 |
| 7048 | 6×10 7 | 2,0×10 7 | 2×10 8 | 10 4 | 10 9 |
| IC-831-1-4 | 1×10 8 | 2×10 8 | 1,5×10 9 | 10 2 | 10 9 |
| IC-832-1-4 | 1,4×10 9 | 1,0×10 8 | 3×10 10 | 10 2 | 10 10 |
| IC-833-1-4 | 2,0×10 8 | 3,9×10 10 | 1,0×10 10 | 0 | 10 11 |
| IC-834-1-4 | 1×10 9 | 3×10 9 | 2,3×10 10 | 0 | 10 11 |
2. Для количественного учета динамики изменения кишечной микрофлоры ежедневно производили высевы из фекалий мышей всех опытных групп по стандартной схеме обследования на дисбактериоз, включающей:
— определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) с нормальной ферментативной активностью на среде Эндо и среде Левина;
— энтерококков на полимиксиновом агаре;
— лактобактерий на среде Бликфельдта;
— условно-патогенных микроорганизмов на среде Плоскирева и желточно-солевом агаре;
— бифидобактерий на тиогликолевой среде.
В таблице 9 приведены данные по восстановлению микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Анализ таблицы 9 показывает высокую эффективность восстановления кишечной микрофлоры животных по сравнению с контролем и коммерческим препаратом-пробиотиком Ветом 3 (штамм В. subtilis ВКПМ В 7048).
Показания к применению (рекомендательные). Препараты на основе штаммов Bacillus stearothermophilus IC-831-1-4, IC-833-1-4, IC-834-1-4 рекомендуется использовать для профилактики и лечения дисбактериозов сельскохозяйственных и диких птиц, в том числе кур, уток, гусей, индеек, цесарок и других, повышения естественной резистентности организма птиц, устранения иммунодефицитных состояний, вызванных инфекционными (вирусы, бактерии, простейшие, внутриклеточные) и неинфекционными (некачественные корма, скученное содержание, стресс вследствие несоблюдения температурных режимов содержания) факторами, увеличения сохранности поголовья, увеличение яйценоскости, получения дополнительных привесов бройлеров, снижения конверсии кормов, уменьшения времени выращивания птицы. Профилактики и лечения дисбактериозов всех видов продуктивных сельскохозяйственных животных, лечения инфекционных заболеваний бактериальной и протозойной этиологии, профилактики вирусных заболеваний и иммунодефицитных состояний, повышения сохранности молодняка в ранние периоды развития, повышения продуктивности, получения дополнительных привесов.
Препараты на основе штаммов Bacillus stearothermophilus IC-832-1-4 рекомендуется использовать для профилактики и лечения дисбактериозов крупного рогатого скота, лечения инфекционных заболеваний бактериальной и протозойной этиологии, профилактики вирусных заболеваний и иммунодефицитных (первичных и вторичных) состояний, повышения сохранности молодняка КРС в ранние периоды развития, повышения продуктивности молочного животноводства, получения дополнительных привесов молодняка мясного животноводства, улучшения качества и сортности молока и мяса, продления фертильности маточного поголовья.
1. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, обладающий
бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10561.
2. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-832-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10562.
3. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-833-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10563.
4. Штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-834-1-2, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10564.
5. Препарат, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, характеризующийся содержанием наполнителя с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, или ВКПМ В-10562, или ВКПМ В-10563, или ВКПМ В-10564, или их смесь с титром каждого штамма бактерий не менее 1·10 3 КОЕ/г или 1·10 3 КОЕ/мл.
6. Препарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит воду.
7. Препарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит порошкообразный сорбент.
8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что в качестве порошкообразного сорбента он содержит цеолит, или полисахарид, или моносахарид, или дисахарид, или смесь полисахарида с моносахаридом или полисахаридом в соотношении от 1:100 до 1:10.