Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей
Микроскопическая техника Гистологическая техника Гематоксилин Обзорные окрашивания Методы окраски тканей Окрашивание нервной ткани Окрашивание костной ткани Кровь: методы окраски Окрашивание азаном по методу Гейденгайна Микротом для парафиновых срезов МПС-2
Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей
Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.).
Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.
Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем— цитоплазма.
Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.
Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.
Железный гематоксилин Гейденгайна
окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2—12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1—36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.
Железный гематоксилин Вейгерта
Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2—5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.
Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.
Методика окрашивания азур-2-эозином.
Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 110-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время, от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.
Ниже описаны методики, и прописи красителей в частности гематоксилина и его приготовление для окраски срезов из книги Р. Лилли
ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ
ПРОТРАВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЯДЕР И ДРУГИХ СТРУКТУР
Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще лучше в кислых растворах. Многие авторы предпочитают перекрашивать срезы не подкисленными растворами красителя, а затем дифференцировать их в кислоте, подкисленном спирте или других дифференцирующих агентах.
Квасцовый гематоксилин, приготовленный на 10%-ном водном растворе алюмо-аммониевых квасцов, имеет рН около 2,95; при добавлении 2% уксусной кислоты рН сдвигается до 2,34, при добавлении 4% — до 2,22.
Отмечено, что содержание гематеина в различных партиях поступающего в продажу гематоксилина различно, так что краситель иногда может представлять собой почти чистый гематеин. У меня имелись образцы гематоксилина, которые «вызревали» «естественным путем» за сравнительно короткий срок (8—10 дней). Обычный срок вызревания составляет 8—10 недель, хотя, по данным Шморля, период вызревания для гематоксилина Бемера составляет 8—10 дней. Иногда встречаются партии гематоксилина, которые оказываются сильно «переокисленным» при добавлении стандартных количеств иодата натрия. Я могу привести пример, когда 1 г NaIО3 окисляли 6 г гематоксилина. Это соотношение ниже, чем в прописи Майера, но выше рекомендованного.
Хорошо «вызревшие» растворы квасцового гематоксилина разбавляют дистиллированной водой до концентрации приблизительно 10 мг гематоксилина в 1 л. При «переокислении»- независимо от того, достигнуто ли оно за счет длительного выдерживания на воздухе или избыточной дозы окислителя,— раствор меняет цвет от пурпурного через красный до оранжевого или даже желто-коричневого.
Для приготовления растворов гематоксилина с хорошими красящими свойствами на 1 г гематоксилина обычно берут 177 мг перманганата калия, 200 мг иодата натрия и 500 мг окиси ртути, но, как было показано недавно, количества некоторых из зтих окислителей можно уменьшить.
переокисленвые растворы гематоксилина при добавлении 30% глицерина восстанавливали при стоянии свою способность к окрашиванию.
В табл. 1 приведен ряд наиболее часто употребляемых прописей приготовления
квасцовых гематоксилинов из расчета на 1 л раствора. В некоторых методах рекомендуется сначала растворить гематоксилин в спирте или в воде и окислить либо на воздухе, либо добавляя окислители. По-видимому, не имеет значения, добавляются ли квасцы, глицерин, вода, уксусная кислота и другие компоненты к гематоксилину до или после его окисления; не важен и метод окисления. Спирт и глицерин могут сами окисляться химическими окислителями.
Пропись Делафильда цитируется по Майеру («Энциклопедия» Эрлиха).
Я беру 60 г квасцов, что несколько превышает количество, необходимое для получения раствора 1 : 11, который Майер считает насыщенным. Маллори советует применять 15%-ный раствор квасцов и во всех прописях использует этиловый спирт. Последняя рекомендация кажется полезной.
Прописи для приготовления 1 л квасцовых гематоксилинов
3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.
4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше «вызреет» и окраска будет лучше).
6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.
7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).
8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.
10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.
После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.
Методика окрашивания гематоксилином и эозином целлоидиновых срезов
1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.
2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.
3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.
4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.
5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.
6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.
7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.
Окрашивание срезов для обзорных целей
Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.
Ядерные (основные) красители.Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.
Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).
Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.
гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl3, 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.
Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Кислые красители.Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.
Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.
Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.
В качестве обзорной окраски можно рекомендовать также железный гематоксилин-пикрофуксин по Ван-Гизону.
Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифференцируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез фильтровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашивании гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.
Окрашивание гематоксилином Цитируется: Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; [пер. с немец. В.Александрова]. – М.: Издательство иностранной литературы, 1953. – 718 с. (с.161-164)
673. Для выявления тончайших плотно лежащих структур целесообразнее пользоваться срезами толщиной 3—5 мкм. Для обзорных препаратов, напротив, можно употреблять срезы толщиной 10—15 мкм. Так как белок сильно подкрашивается железным гематоксилином, то лучше всего наклеивать срезы водой. Во всяком случае, нужно наносить при наклейке очень тонкий слой белка. Для окраски железным гематоксилином целлоидиновых срезов их лучше всего наклеить, а целлоидин растворить (см. 557), так как он сильно подкрашивается и даже при длительной дифференцировке удерживает довольно темный коричневый тон. Растворять целлоидин нужно до протравы в железных квасцах, так как иначе он становится трудно растворимым. Выявление отдельных структур можно до известной степени облегчить предварительной обработкой препарата. Так, например, окраска центросом удается легче, если срезы (лучше всего фиксированные в растворах, содержащих сулему) перед окраской железным гематоксилином предварительно окрасить 0,1-процентным раствором бордо R. После такой окраски в дальнейшем цитоплазма и ядра дифференцируются быстрее, чем центросомы. 674. Железным гематоксилином можно окрашивать также и прогрессивно. Для этого предварительно протравленные препараты держат в гематоксилине лишь до тех пор, пока не будет достигнута желательная окраска. Затем основательная промывка в простой воде; спирт, ксилол, бальзам. 675. На материале, фиксированном осмием, почернение, обусловленное осмиевой кислотой, в известных условиях может помешать окраске железным гематоксилином. В этом случае рекомендуется до протравы железными квасцами отбеливать препараты (см. 983 или 1013). 676. От дополнительной окраски препаратов, окрашенных железным гематоксилином, во многих случаях приходится отказаться, так как фон обычно и так уже несколько подкрашен и при дополнительной подкраске четкость препаратов часто снижается. Если все же желательна более сильная подкраска цитоплазматических структур, волокнистых структур и т. п., то препараты, окрашенные железным гематоксилином, можно после промывки перенести еще на 5—10 мин. или более в 0,1-процентный водный раствор рубина S (кислотного фуксина, оранжевого G, светового зеленого и т. п.). Затем споласкивают в 50-градусном спирте и т. д. Очень четкая стойкая подкраска, особенно волокнистых структур (соединительная ткань, базальная мембрана), получается на срезах, протравленных железными квасцами (!) при употреблении бензо-светового бордо. Для этого 1 г красителя растворяют в 100 см3 96-градусного спирта (Гейденгайн, 1926).
Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну
1. Срезы из воду поместить в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов (ЖАК) на 10 при 37 С (в термостат), раствор можно нагреть предварительно. 2. Дважды промыть в дист. воде по 2 мин. 3. Перенести в раствор гематоксилина при 37 С (нагреть предварительно) на время, достаточное для почернения до цвета смолы (обычно достаточно 10 мин). 4. Промыть в 2-х порциях дист. воды 5. Дифференцировать в 2,5 % растворе ЖАК (можно разбавить, если срезы быстро терят краску). Время дифференцировки подбирается при каждом окрашивании (в среднем 1-5 мин). 6. Промыть в дист. воде 3 раза по 5 мин. 7. Провести через спирты, ксилол, бальзам.
Растворы : 1. Гематоксилин Гейденгайна: 500 мг гематоксилина растворить в 10 мл 96% спирта и довести дист. водой до 200 мл, прибавить 100 мг NaJO 3 и оставить на 1 ч. При комнатной температуре хранится долго. 2. 8 г железоаммонийных квасцов растворить в 200 мл воды.
Окрашивание срезов для обзорных целей
Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.