фермент липаза что это такое

Фермент липаза что это такое

ФГБОУ ВО « Адыгейский государственный университет»

ЛИПАЗА: СВОЙСТВА, ИСТОЧНИКИ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ

Аннотация. Представлен анализ отечественной и зарубежной литературы в области современных представлений об особенностях строения, функционирования, получения и использования липазы разного происхождения в различных областях промышленности.

Ключевые слова : липаза, триацилглицеролацилгидролаза, активность фермента, ингибирование, триглицериды.

Adyghe State University

LIPASE: SOURCES, METHODS OF OBTAINING, APPLICATION

Abstract. The analysis of domestic and foreign literature in the field of modern ideas of features of the building, functioning, receiving and use of a lipase of different origin in various fields of the industry is submitted.

Keywords : lipase, triatsilglitserolatsilgidrolase, activity of enzyme, inhibition, triglycerides.

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции, которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом [16]. Создание промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов помогает существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы [16, 22]. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться, и расширяться.

В этой связи большой интерес для многих отраслей народного хозяйства, где необходим частичный или полный гидролиз жиров и масел представляют липазы. Они находят применение в пищевой и легкой промышленности, сельском хозяйстве, медицине, в бытовой химии, коммунальном хозяйстве и в аналитической практике.

Целью работы явилось изучение современных представлений о механизмах функционирования, способах получения и применения в промышленности липаз различного происхождения.

Липолитические ферменты (липазы) — группа ферментов, катализирующие реакции гидролитического расщепления жиров с образованием моно- и диглицеридов и свободных жирных кислот, при этом наибольшее сродство фермент проявляет к эфирным связям, расположенным на внешней части молекулы триглицерида [25].

По классификации ферментов липазы относятся к эстеразам (класс гидролаз). Фермент водорастворимый, который катализирует гидролиз нерастворимых эстеров – липидных субстратов, помогая переваривать, растворять и фракционировать жиры. По номенклатуре ферментов липаза имеет название триацилглицеролацилгидролаза (КФ 3.1.1.3), ее рекомендуемое рабочее название — триацилглицероллипаза; фермент имеет еще названия: стеапсин, трибутираза, липаза триглицеридов.

Характерной особенностью гидролитических ферментов, в том числе липаз, можно назвать уникальные физико-химические условия катализируемых ими реакций [1, 4, 18, 19]. Процесс катализа происходит на поверхности раздела фаз, фермент катализирует расщепление эфиров ненасыщенных и насыщенных алифатических кислот, с не менее чем 12 атомами углерода в цепи и способен катализировать не только гидролиз, но и обратные реакции трансэтерификации, этерификации, ацидолиза и алкоголиза [22] (рисунок 1).

Рисунок 1 Схема гидролиза и синтеза триацилглицерола (по Е.С. Северину)

Установлено [19], что чем выше степень деспергирования субстрата, тем быстрее идет липолиз. Вероятно, это связано с явлением сорбции фермента на поверхности субстрата. Считается, что именно этот процесс является первым актом ферментативного липолиза. От гомогенности субстрата напрямую зависит скорость липолиза, что многие авторы связывают с явлением абсорбции фермента на поверхности субстрата [13]. Полный гидролиз осуществляется тремя липазами (рисунок 2).

Рисунок. 2 Действие липазы на субстрат (по Е.С. Северину)

По мнению ряда авторов, [5, 16, 41, 42], активный центр липаз можно разделить на три участка, имеющих функциональные различия: первый — контактный, ответственный за идентификацию поверхности субстратной фазы; второй – гидрофобный связывающий участок, осуществляющий извлечение одной молекулы субстрата из субстратной фазы в глобулу фермента; третий – образованный группами, инициирующий каталитический акт гидролиза сложноэфирной связи [5, 43] (рисунок 3).

Рисунок 3. Схема организации активного центра липаз (по данным М. Рахимова, 1981г.)

Липаза также, способна гидролизовать как природные, так и синтетические субстраты с различной структурой [15, 16]. Некоторые авторы [11, 12, 13] в качестве особенностей липазы выделяют ее поверхностную активацию, т.е. резкое увеличение активации при концентрации субстрата, превышающей предел ее растворимости. Липазы катализируют гидролиз, синтез, трансэтерификацию эфиров.

Установлено, что большинство липолитических ферментов в своем активном центре содержат сериновую триаду Ser-Gis-Asp (рисунок 4).

Рисунок 4. Модель молекулы растительной липазы [35]

Липазы различного происхождения проявляют сродство к определенным кислотным остаткам. Так, панкреатическая липаза обладает высокой специфичностью к расщеплению связи с участием остатка олеиновой кислоты, а связи, образованные пальмитиновой кислотой, гидролизуются значительно медленнее. Известно, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолекулярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты, т.е. нерастворимые в воде субстраты. Водорастворимые субстраты. Для выяснения механизма каталитического действия липолитических ферментов, можно проводить исследования с водорастворимыми субстратами [41]. Липазы способны гидролизовать водорастворимые субстраты (таблица1).

Таблица 1 Влияние вида липидного компонента на биосинтез липазы культурой R. oryzae 14-14 [26, 27,30]

Активность липазы, % к контролю

Соевое масло (контроль)

Для получения комплексов из поджелудочной железы свиньи готовят растворы липазы и полистиролсульфоната-Na (ПСС) с концентрациями 10-5 М, затем смешивают растворы липазы и ПСС в различных соотношениях от 100:1 до 1:100. Полученный раствор пропускают через фильтр с размером пор 450 нм. Далее из коэффициента диффузии рассчитывается диаметр наночастиц. Все измерения в данном исследовании проводят при температуре 25 C. В анализаторе Nano ZS используется гелий-неоновый (He–Ne) лазер мощностью 4 мВт, работающий при длине волны 633 нм.

Известен способ получения липазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и его очисткой. Однако время культивирования этого продуцента, а также других известных продуцентов не менее 5 б ч. Это приводит к тому, что в культуральной жидкости, примерно с конца вторых суток, идет накопление наряду с липазами и протеаз, которые снижают со временем липазную активность. Для уменьшения влияния протеаз в культуральную жидкость вводят стабилизаторы. Все это ведет к усложнению и удорожанию ферментационных процессов.

Получение препаратов липаз и их очистка проводятся из фильтратов культуральной жидкости. Биомасса продуцента отделяется центрифугированием или фильтрованием. Жидкая фаза культуры стабилизируется солями и концентрируется ультрафильтрацией или вакуум-выпариванием. Полученный концентрат может непосредственно высушиваться для получения технических препаратов (Г3х). Однако чаще проводят выделение фермента осаждением органическими растворителями или сульфатом аммония. Для получения высокоочищенных препаратов липаз широко используют все методы хроматографии, электрофорез, гель-фильтрацию и изофокусирование.

Применение в промышленности. В последнее время значительную долю рынка промышленных ферментов (около 70 %) составляют гидролазы, включающие липазы, применяющиеся в процессах переэтерификации жиров, органическом синтезе, для разделения рацемических смесей и получения ароматических добавок. Наибольшие успехи достигнуты в применении липаз в составе биокатализаторов для переэтерификации жиров, получения биотоплива и в качестве добавок к поверхностно-активным веществам [1]. Наиболее востребованы липазы грибов и бактерий, принадлежащих к экстремофильным микроорганизмам (таблица 2)

Таблица 2 Промышленное использование микробиальных липаз [8]

Продукты на основе молока

Гидролиз молочных жиров, модификация сливочного масла

Ароматизирующие агенты сыра и масла

Улучшение аромата и продление срока хранения

Майонез, другие приправы

Переработка мяса и рыбы

Улучшение аромата и удаление жира

Мясные и рыбные продукты

Масло какао, маргарин, жирные кислоты, глицерин, ацилглицеролы

Хиральные соединения и реагенты

Препараты для нормализации пищеварения

Эмульгаторы, увлажняющие агенты

Пищевая промышленность. Использование липаз в пищевой промышленности включает четыре основных направления: 1) улучшение пластичности масла; 2) получение аналогов масла какао; 3) повышение пищевой ценности триглицеридов; 4) получение сыров. Первые из трех направлений основаны на переэтерификации природных триглицеридов, катализируемой специфичными липазами. Получение жиров с улучшенной пластичностью Пластичность маргарина, получаемого гидрогенизацией ненасыщенных триглицеридов растительных масел, зависит от степени ненасыщенности получаемого продукта. В то же время, гидрогенизация растительного масла может приводить к формированию нежелательных транс-изомеров ненасыщенных жирных кислот, вредных для здоровья человека [17]. В связи с этим, желаемую пластичность масел можно получить переэтерификацией соответствующей смеси насыщенных и ненасыщенных триглицеридов, катализируемой 1,3-специфичными липазами и неспецифическими липазами [35]. Получение аналогов масла какао, температура плавления которых близка температуре тела человека, их используют в производстве шоколада и суппозитарных основ медицинских препаратов.

Многие триглицериды, входящие в состав детского питания, производятся переэтерификацией триглицеридов с использованием специфичных липаз [32]. Прием пищевых триглицеридов, содержащих ненасыщенную жирную кислоту, например, эйкозатстраеновую или декозагексаеновую кислоту, предотвращает развитие сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний. Некоторые триглицериды этого типа производят переэтерификацией триглицеридов рыбьего жира, катализируемой специфичными липазами [32, 33], которая в отличие от химического метода не приводит к образованию продуктов побочного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Кроме того, липолитические ферменты косвенно влияют на окислительные процессы в тесте при замесе, что происходит за счет увеличения доступности ненасыщенных жирных кислот для действия фермента липоксигеназы, присутствующего в муке или введенного в тесто в составе улучшителей. Фермент липоксигеназа катализирует свободнорадикальное окисление ненасыщенных жирных кислот с образованием в качестве промежуточных соединений свободных радикалов, а также неустойчивых в сложной биологической среде гидропероксидов стадия 2 [6]. Эти вещества участвуют в реакциях окисления сульфгидрильных (-SH) групп с образованием дополнительных дисульфидных (-S-S-) связей в белковых цепях (стадия 3), в результате чего происходит улучшение реологических свойств клейковины [1, 20].

Получение сыров. Сычужная «паста», выделяемая из желудка жвачных животных, представляет собой смесь ферментов, используемых в производстве сыров. Ее активными компонентами являются эстеразы, липазы, химозин и протеазы.

Применение липаз разной субстратной специфичности позволяет получать различные вкусовые свойства сыров, в том числе и его аромат, а также ускорять созревание сыра [17]. Применение липаз е хлебопекарной промышленности Ферментные препараты липаз в больших объемах применяют сегодня в мукомольной и хлебопекарной промышленности.

Получение моноглицеридов Ферментативный метод получения моноглицеридов, используемых в качестве природных эмульгаторов в производстве пищевых продуктов, косметических средств и лекарственных препаратов, включает либо катализируемый специфичными липазами гидролиз триглицеридов, либо этерификацию глицерина жирными кислотами, эфирами жирных кислот и триглицеридами [23].

Производство моющих средств. Использование липаз в составе стиральных порошков и моющих средств, позволяет удалять жировые пятна без деструкции тканей и использовать умеренные температуры стирки [23], Компания Novo-Nordisk является первой компанией, получившей для этих целей препарат Lipolase (рекомбинантную грибную липазу из Humicola lanuginose, экспрессированную в Aspergillus oryzae) [23]. Бумажное производство Компания Nihon Seishi Со. (Япония) разработала метод обезжиривания сырьевой древесины с использованием липаз [14], что оказалось намного эффективнее скипидарного метода, используемого теперь лишь в производстве бумаги низкого качества.

Текстильное производство. Обработка ткани липазой приводит к повышению водопоглощения текстильных материалов, и их капиллярность после обработки составляет более 120 мм. Этот эффект обусловлен способностью липаз катализировать реакцию гидролитической деструкции воскообразных веществ, придающих суровой ткани свойство несмачиваемости. В отличие от процессов омыления воскообразных веществ в присутствии щелочного агента деструкция восков под действием липаз проходит при температурах от 40 до 60°С. При обработке композицией ферментов дополнительный эффект гидрофилизации ткани обеспечивается активностью оксидаз за счет ступенчатого окисления предельных жирных кислот [27].

Органический синтез. Одним из примеров использования липаз в органическом синтезе является получение ацилированных гликозидов [22, 23], эмульгаторов, проявляющих противомикробные и противовоспалительные свойства, которые нашли широкое применение в косметической промышленности и в производстве моющих средств. Другим примером катализируемого липазами синтеза является получение гликозилглицеридов [33], используемых в качестве противоопухолевых средств, и эфиров алкилгликозидов и а-гидроксикислот [35], используемых в качестве натуральных компонентов косметических средств, значительно улучшающих эластичность кожи.

Получение производных а-гидроксикислот необходимо для предотвращения раздражения кожи, вызванного уменьшением значений рН, а также для лучшего проникновения в слои эпидермиса. Эфиры спиртов и короткоцепочечных кислот, являющиеся ароматизаторами и парфюмерными отдушками, также получают этерификацией спиртов, катализируемой липазами [30, 31]. Катализируемое липазами кинетическое разделение рацемических спиртов или сложных эфиров и асимметризация прохиральных мезополиолов или их эфиров являются удобными методами стереодивергентного синтеза хиральных биоактивных молекул, имеющих фармацевтическое применение [3]. Благодаря высокой селективности липаз, оказалось возможным получение оптически активных полимеров из рацемической смеси мономерных соединений [2]. Так, например, этерификацией различных моносахаридов винилакрилатом, катализируемой липазой, и последующей полимеризацией акрилового эфира, получают растворимые в воде полиакрилаты, способные сшиваться и образовывать нерастворимые в воде материалы с высокой водоадсорбирующей способностью [21].

В производстве биодизеля. Липазный катализ в производстве биодизеля призван избавить его от принципиального недостатка – большого количества щелочных отходов, снизить удельные затраты воды и энергии. В экономическом плане сегодня липазный катализ проигрывает щелочному, однако, в работе [33] показано, что при современных ценах на липазу, производство биодизеля рентабельно начиная от объемов от 200 тыс. т./год. Предположительная цена биодизеля, если не применять при его получении растворитель (в этом варианте технология нерентабельна), окажется равной 0,73–1,49 €/кг при текущей цене липазы, и 0,05–0,75 €/кг при прогнозируемой цене фермента в будущем. Стоит добавить, что цена ферментов, помимо увеличения масштабов производства, может быть снижена путем применения технологий рекомбинантных ДНК. Таким образом, ферментативный способ производства биодизеля при создании крупных производств и соответствующей экологической политике государства уже в ближайшем будущем сможет конкурировать со щелочным катализом.

В синтезе ароматических средств. В настоящее время исследователи во многих странах [7] стали уделять внимание ферментативному синтезу душистых веществ. Благодаря высокой каталитической активности и непревзойденной субстратной специфичности ферментов, их применение для синтеза душистых веществ может иметь высокую экономическую эффективность. Для этого наиболее часто используют свободные или иммобилизованные липолитические ферменты, проводя реакции в неводных средах.

Мицеллярные системы представляют собой универсальную микрогетерогенную среду для ферментативных реакций. Спонтанное образование мицелл идет в самых различных 212 органических растворителях, таких, как углеводороды (например, октан или бензол), высшие спирты, хлороформ, а также в их смесях. В качестве мицеллообразующего материала пригодны широко используемые в биохимии детергенты, например, додецилсульфат натрия, алкилированные полиэтиленгликоли (бридж, твин или тритон) или же природные фосфолипиды. Известны как нормальные мицеллы, существующие в воде (при не слишком большой концентрации органических добавок), так и обращенные мицеллы в органических растворителях при умеренном содержании воды. Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ. Имеются данные, свидетельствующие о возможности синтеза этиллаурата в среде гексана с помощью нанокатализаторов панкреатической липазы, с выходом эфира более 80%.

Таким образом, применение ферментных препаратов различной степени очистки позволяет не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но и дает возможность усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

В настоящее время накоплено достаточное количество информации о биологической роли и механизме катализа, для большинства видов липаз установлены особенности строения активного центра и некоторые свойства. Однако трудно найти достаточно полную информацию с точки зрения получения чистого препарата липазы, поэтому проблема глубокого изучения нативных препаратов липолитических ферментов, а также разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении. Недостаточно разработанной является методология применения не извлеченных ферментов в аналитических целях, для расширения определяемых показателей, в том числе, в определении токсичных элементов в растительном сырье, где присутствие токсичных элементов выступает одним из негативных факторов, оказывающих при попадании в организм человека и животных токсическое и мутагенное действие. Остаются актуальными вопросы, связанные с совершенствованием технологии получения ферментных препаратов растительного происхождения для аналитических целей.

Источник