Биотоки человека что это

ВНУТРИТКАНЕВАЯ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ (ВТЭС)

Метод внутритканевой электростимуляции – современный немедикаментозный метод лечения заболеваний позвоночника, суставов, головной боли, болевых синдромов. Научная разработка профессора Андрея Александровича Герасимова утверждена и рекомендована Минздравом РФ к внедрению и широкому использованию в практике. Метод Герасимова имеет высокий показатель эффективности и с успехом используется во многих клиниках и санаториях России и зарубежных стран. ВТЭС по Герасимову – уникальный метод, не имеющей аналогов в мировой практике.
Методика лечения защищена патентом, разрешена МЗ РФ и внесена в государственный реестр под №2001/115. По данному методу защищены диссертации, написано много научных работ.

Низкочастотный ток, соответствующий биотокам человека, через тонкую иглу-проводник подводится вплотную к пораженному участку костной ткани. Непосредственное воздействие на болевую зону улучшает микроциркуляцию крови, нормализует кровоток, снимает спазмы мышц и отеки.
Самое главное его действие – это быстрое устранение костно-болевого синдрома и восстановление нервов, идущих из позвонка к конечностям. Этот уникальный эффект происходит только при внутритканевой электростимуляции. Метод быстро устраняет любую нейропатическую боль в нервах, применяется при межпозвонковых грыжевых выпячиваниях.

Преимущества

· Биоток подводится непосредственно к пораженной ткани, минуя кожу и мышцы, которые препятствуют прохождению токов.

· Практически не имеет противопоказаний.

· Эффект воздействия на нервные рецепторы в 20 раз сильнее, чем при обычной игло-рефлексотерапии.

· Имеет стойкий продолжительный эффект, в 2-3 раза снижает частоту обострений

· Лечение амбулаторное, без медикаментов и без операций позволяет вылечить даже сложные заболевания опорно-двигательного аппарата и грыжи дисков.

· Исключает аллергические реакции и другие побочные эффекты фармакологической терапии.

· Срок лечения уменьшается в 2-3 раза.

Эффект лечения

Показания к применению внутритканевой электростимуляции

• Боль в различных отделах позвоночника и опорно-двигательного аппарата
• Остеохондроз, боли в конечностях, боли м/д лопаток, прострелы в пояснице, онемение пальцев
• Позвоночная грыжа, протрузия диска
• Артрозы крупных суставов. Плече-лопаточный периартроз
• Сколиоз
• Повреждение периферических нервов
• Головная боль, вегето-сосудистая дистония, мигрень, шум в ушах, головокружение
• Нарушения мозгового кровообращения, снижение памяти и когнитивных функций мозга.
• Травмы опорно-двигательного аппарата
• Пяточная шпора

Системные заболевания крови; декомпенсация сердечной деятельности; нарушение кровообращения выше II степени; злокачественные новообразования; беременность; активный туберкулез легких и почек; острые внутрисуставные повреждения; острые гнойные воспалительные процессы; гиперчувствительность к импульсному току; имплантированный кардиостимулятор; эпилепсия; острая стадия ревматоидного артрита.

Представления о механизмах боли

Основным вопросом лечения болевых синдромов является вопрос о первичном источнике болевых импульсов, из какой ткани они исходят. Главными причинами болевого синдрома считаются дистрофические изменения и грыжевые выпячивания межпозвонкового диска, соответственно этому строится и лечебная тактика. Однако, существуют другие критерии оценки тяжести поражения и другие источники раздражения нервных рецепторов позвоночных тканей. Причины возникновения боли чаще не связаны с грыжевыми выпячиваниями.

В последние годы накопилось достаточно данных, чтобы утверждать, что источником боли является сама кость с ее остеорецепторами, которые относятся к симпатической нервной системе.

Первоначальные изменения при дистрофических заболеваниях происходят вначале в костной ткани в виде локального остеопороза с разрушением костных балок, застойных явлений крови в венозной системе и повышения внутрикостного давления. Происходит нарушение кровообращения кости. Остеорецепторы реагируют на уменьшение парциального давления кислорода в костных сосудах – возникает боль. Доказано, что чем хуже кровообращение кости, тем больше усиливается интенсивность боли.

В последующем изменения охватывают надкостницу. Патология в костной ткани прогрессирует постепенно чаще годами. Болевые проявления локализуются в костях, не вызывая вначале болевых ощущений. Важным клиническим признаком прогрессирования процесса является вовлечение мышц, которое носит вторичный характер. Раздражение остеорецепторов прогрессивно увеличиваясь, вовлекает в процесс нервы, распространяя боль на периферию. Нарушение трофики костей на конечностях, обусловливает боль при пальпации по ходу костей. Боль в конечность иррадиирует не по нервам, а в основном по костям, фасциям. Такой характер боли называется рефлекторным.

Нарушение кровообращения в костях является первичным звеном в отношении дистрофических явлений не только в межпозвонковых дисках, но и во всех суставах конечностей. Как известно, питание гиалинового хряща происходит за счет диффузии из костной ткани тел позвонков. Даже небольшие нарушения прямого артериального кровоснабжения кости или венозного полнокровия приводят к резкому уменьшению процессов диффузии питательных веществ в матрикс хряща. Нарушение этого питания является основой для возникновения биохимических нарушений в гиалиновом хряще суставов и возникновения дистрофических явлений. Продукты распада гиалинового хряща обладают аутоаллергическими свойствами и вызывают в окружающих тканях отек, боль и все те клинические явления, которые известны при остеохондрозе и остеоартрозах.

Так формируется «костно-болевой синдром», который определяет патогенетическую сущность заболевания. Внутритканевая электростимуляция воздействует на причину заболевания, что способствует скорейшему выздоровлению.

ООО «МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ПЛЮС»

ВНУТРИТКАНЕВАЯ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ ( ВТЭС ) по методу проф. Герасимова А.А.

г.Ярославль, ул.Базовая д.3, стр.2.телефон: (4852) 58-28-88

Источник

Что такое биоэнергетика

Множество людей неоднократно задавались вопросом, что такое биоэнергетика. Есть несколько ответов на этот вопрос. В первую очередь это наука, которая изучает различные процессы, происходящие в клетках. Во вторую очередь – это наука о производстве энергетических и биологических видов топлива. Но чаще всего это понятие относят к той же сфере, к которой принадлежит и эзотерика, ассоциируют с аурой и нирваной. Хотя зачастую в них вкладываются совершенно разные значения. Чаще всего биоэнергетика воспринимается как что-то связанное с экстрасенсами, но это не совсем правильно. Однако очень распространено мнение, к которому прислушивается множество людей, о первенстве энергетической составляющей человеческого организма, а затем уже физической и материальной.

Человек под биоэнергетикой подразумевает особенные экстрасенсорные способности определенных людей, которые можно определить визуально. Например, столкнувшись с неприятным человеком, люди думают, что он является источником негативной энергии, неким энергетическим вампиром. А добрый человек является источником исключительно положительной энергии, готовым делиться ею с окружающими. Поэтому люди всегда стремятся к гармонии, как физического состояния организма, так и энергетического. И при наличии определенных биоэнергетических знаний это им удается.

Понятие биоэнергетики

Существование понятия биоэнергетики как источника энергии вошло в быт человечества, но понимание сущности до конца осталось не определено. Каждый человек, независимо от возраста, что старик, что ребенок, смогут объяснить, что человеческий организм имеет некую оболочку, возможно, и не одну. Прекрасно знают также и об ауре, энергетика которой может быть различной. Но не все люди знают, как возобновлять собственный энергетический потенциал, потому что не рассматривают биоэнергетику относительно себя. Не каждый человек имеет представление о том, как распоряжаться собственным энергетическим потенциалом. А на самом деле мы имеем возможность:

Длительный период времени ученые всего мира пытаются изучать воздействие биоэнергетики на личность человека. На эту тему написано множество научных статей и различного рода литературы. В некоторых словарях можно найти такую трактовку понятия биоэнергетика, как:

В современном мире биоэнергетика таким образом достаточно изучена, но есть множество людей, которые сомневаются в существовании источника человеческой энергии и относят данную науку к шарлатанству. Однако, ни для кого не секрет, что каждый человек имеет свое энергетическое поле, которое подвержено влиянию окружающей среды и других факторов. В свою очередь такое поле оказывает существенное влияние и на окружающий мир. А энергия каждого человека является составляющей энергетического потока Вселенной.

Биополе человека

Каждый человек имеет свое биологическое поле. В древние времена прекрасным подтверждением этому являлись изображения, на которых можно было проследить свечение фигур, нимбы над головой, что свидетельствовало о наличии чего-то сверхъестественного, но невидимого глазу. Это известно всем. Но, не каждому дано увидеть биополе другого человека. Такими способностями наделены немногие. Но, к сожалению, существует множество таких людей, которые искажают представление общественности о биоэнергетике, обманывая в наличии у себя определенных способностей в этой области.

Пополнение человеческой энергии совсем не сложный процесс, но не каждый способен это делать самостоятельно. Есть два основных способа пополнения энергетических запасов человека, такие как:

Наверняка каждый человек не раз замечал в себе и в окружающих его людях перемену настроения в худшую сторону, упадок сил и работоспособности. Это напрямую зависит от биополя и умения его подпитать. Одни люди предпочитают заряжаться от других, занимаясь так называемым энергетическим вампиризмом, хотя это неправильно. А другие, напротив, желая оказать помощь другому человеку, пытаются зарядить его своей энергетикой, видя, как человеку становится плохо и он не в состоянии подзарядиться самостоятельно. Но и в этом случае не все так хорошо, так как постоянное использование подпитки от окружающих может навредить не только тому, кто пытается оказать помощь, но и тому, кто хочет ею воспользоваться.

Биоэнергетика вещей

Любой предмет не может являться самостоятельным носителем негативной или позитивной энергии. Он может только лишь представлять механизм передачи энергетического поля, напитавшись той или иной энергии от человека. Только люди способны заряжать предмет биополем, посредством:

Биоэнергетика: от древности до настоящего времени

Еще в давние времена люди имели познания в области человеческой энергетики. Они были уверены, что ничто не может происходить на Земле без связи с Вселенной. И, опираясь на эти знания, пользовались природными ресурсами в качестве источников энергии. Со временем и развитием цивилизации человек стал забывать, чем обязан природе, и лишился возможности использовать ее как живой энергетический источник для подзарядки.

Каждый человек несет непосредственную ответственность за свои поступки, мысли, действия. И сознание того, что ничто не проходит бесследно, оставляет отпечаток на людях, меняя их к лучшему и уменьшая в них составляющую негативной энергии.

Так, например, древние китайцы использовали энергетическую сущность, именуемую Ци, в основе которой были заложены три основных понятия энергии:

Древние индийцы на протяжении многих тысяч лет используют для биоэнергетических зарядов человека прану, с помощью которой организм наполняется с каждым вздохом. Греки не мыслят существования человека без биоэнергетических составляющих, на которых основывается и сама человеческая жизнь, что и подтверждается переводом понятия биоэнергетика с греческого языка.

В современном мире не все относятся к энергетическим источникам доверительно, чем показывают свое непризнание нетрадиционных методов медицины. В европейских странах довольно скептически отзываются о таком научном направлении. Но, несмотря на данную постановку вещей, без энергетического биополя не может существовать ни один человек на планете. Люди полностью зависят от энергетических потоков, которыми наполнен человеческий организм. Так как все в мире связано со Вселенной и ничего не происходит без ее влияния.

Не менее часто можно столкнуться с понятиями энергетических потоков в организме человека и в эстетическом аспекте. Так, например, знания в этой области очень помогут в работе косметолога. Благодаря существующим правилам перемещения биоэнергетики по организму человека, косметолог, который знает об этом, с легкостью сможет провести ряд косметических процедур своему пациенту. Он сможет определить участки застоя и зажатости энергетических потоков и использовать это при проведении манипуляций. Тем самым, косметолог исключит неприятные ощущения пациента во время проведения сеанса, а напротив, улучшит кровообращение и общее самочувствие пациента.

Биоэнергетические системы

Существует восемь основных биоэнергетических систем, благодаря которым происходит энергетическое наполнение организма человека, такие как:

Основываясь на различных исследованиях, выделяют и восемь зон, где наиболее часто замечены застои энергетических потоков. К ним относятся такие зоны, как:

Биоэнергетические потоки человеческого организма – это некая терапевтическая наука, которая помогает человеку познать свое тело. Таким образом, он учится владеть своим энергетическим полем, чем все больше и больше раскрывает для себя энергетические возможности своего организма. Это сложная наука, но при желании ею может овладеть каждый человек.

В современном мире существует множество специалистов в этой области, а также различного рода обучающих учреждений и центров. Одной из наиболее популярных школ по обучению биоэнергетическим возможностям человека является школа arcanum.ru. В ней работают специалисты высокого уровня, которые не только сами отлично разбираются в энергетических потоках человеческого организма, но и без труда смогут научить этой науке всех желающих.

Получение достойного образования в данной области может помочь каждому человеку научиться понимать свое тело и правильно рассчитывать расход собственной энергии. Это и не только можно постичь в школе arcanum.ru. Прекрасные преподаватели, имеющие большой опыт работы и высокую квалификацию, с радостью помогут всем желающим разобраться с вопросами энергии. Все, что знают сами, они готовы рассказать своим ученикам. Кроме теоретических знаний преподаватели школы проведут курс практических занятий, на которых познакомят учащихся с различными методиками энергетической подзарядки организма.

Центр Арканум arcanum.ru – это основа приобретения необходимых знаний в области биоэнергетики человека и залог достижения поставленных целей. Навыки и теоретические знания, приобретенные в школе, помогут управлять энергетическими потоками своего организма, а также применять полученный опыт для оказания помощи другим людям. Не менее важны знания в области биоэнергетического поля человека и в различных профессиях. Благодаря профессиональным специалистам центра Арканум arcanum.ru можно без труда добиться больших успехов в различных сферах жизнедеятельности человека. Приходя к нам, человек не только приобретает определенные знания и умения, но и обретает новых друзей и единомышленников. В таком коллективе всегда приятно находиться и получать знания, которых ранее не было.

Предыдущая статья

Источник

Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях

Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях

Нейродегенеративные заболевания характеризуются постепенной потерей нейронов в различных структурах центральной нервной системы. Одной из причин гибели нейронов могут быть нарушения работы митохондрий.

Автор

Редактор

Нейродегенеративные заболевания — это большая группа неврологических расстройств, связанная с постепенным уменьшением количества нервных клеток из-за специфических изменений их метаболизма. К числу этих недугов относят болезни Альцгеймера, Паркинсона и ряд других, более редких патологий (например, хорею Гентингтона). Современные методы лечения имеют ограниченную эффективность и в лучшем случае помогают замедлить их прогрессирование. Если существующие подходы к решению проблемы не работают, значит нужно подойти к ней с другой стороны. И новые данные могут оказаться полезными для разработки более эффективных методов лечения.

Биоэнергетика

Спецпроект о клеточном энергетическом метаболизме, работе митохондрий и АТФ, а также о заболеваниях, связанных с нарушениями функций клеточных «батареек».

Спонсор спецпроекта — «БиоХимМак» — поставщик научного и медицинского оборудования в лаборатории России и стран СНГ.

Статья, которую вы сейчас читаете, является частью спецпроекта «Биоэнергетика», которую «Биомолекула» делает совместно с компанией «БиоХимМак». В цикле уже вышел обзор о болезнях и изменениях клеточного метаболизма [1] и статья, посвящённая нарушению работы митохондрий при онкологических заболеваниях [2]. В них обсуждается роль митохондрий в здоровых клетках и клетках, которые подвержены патологическим изменениям. Эта, последняя статья цикла, рассказывает о митохондриальной дисфункции при нейродегенеративных заболеваниях — болезнях Альцгеймера, Паркинсона и других неврологических расстройствах. Сначала мы обсудим, как при этих болезнях меняется функционирование митохондрий. Затем рассмотрим существующие методы исследования их работы в нервных клетках и использование получаемой при этом информации.

Клетка с севшими батарейками

Каждое из нейродегенеративных заболеваний связано с изменениями разных метаболических путей внутри нервной клетки. Исследования выявили биохимические маркеры, соответствующие каждой из болезней (табл. 1) [3].

Углубленный анализ метаболических изменений в нервных клетках определил, что в патологии каждого нейродегенеративного заболевания в той или иной степени задействованы митохондрии. Митохондрии — это органеллы, которые, несмотря на свой небольшой размер, являются активными участниками ключевых биохимических процессов, протекающих в клетках [1]. Основная функция митохондрий заключается в поддержании энергетического баланса клеток. Эти органеллы поддерживают окислительно-восстановительный баланс клетки и регулируют гомеостаз кальция. С работой митохондрий напрямую связаны процессы запрограммированной и не запрограммированной клеточной смерти.

Обсуждая вопрос энергетического обеспечения, надо вспомнить, что мозг потребляет до 20% всей энергии, вырабатываемой в организме. И если энергетическая функция митохондрий будет нарушена, это быстро скажется на работе центральной нервной системы. Важности митохондриям добавляет то, что нейроны в сравнении с другими типами клеток обладают меньшей способностью самостоятельно получать энергию за счет гликолиза. Получается, изменения в работе митохондрий приведут к тому, что нейрон перестает полноценно выполнять свои функции.

Правила движения митохондрий

Митохондриальная дисфункция при нейродегенеративных заболеваниях хорошо изучена [4]. Одной из ее причин может быть изменение нормальной динамики этих органелл. В нервной клетке с митохондриями постоянно что-то происходит [5]. Они:

Чтобы наглядно представить себе эти процессы, сравним митохондрию с комочком теста на столе при приготовлении пирожков. Если комочек большой, то из него можно сделать два комочка поменьше. Если теста мало, то можно взять другой комочек и слепить их вместе. Когда теста в комке достаточно, он отправляется туда, куда нужно — в угол доски, где его ждет дальнейшее включение в пекарский «метаболизм».

Изменение числа и положения митохондрий в клетке помогает нейрону адаптироваться к изменению функций. Транспорт митохондрий в аксон является реакцией на повышение потребности в энергии. Число митохондрий также меняется в ответ на изменение условий. Если нужно меньше энергии, число митохондрий снижается, а вслед за этим снижается и энергопродукция клетки.

Нарушение динамики митохондрий изменяет их функциональное состояние и приводит к нарушениям в работе нервной клетки (рис. 1).

Рисунок 1. Динамика митохондрий в клетках животных. Митохондрии в нейронах могут разделяться (а) и сливаться (б). Кроме этого, в соответствии с энергетическими потребностями клетки митохондрии могут перемещаться в область аксона и покидать ее (в—д).

Нарушение динамики митохондрий при нейродегенеративных заболеваниях

Мутации в генах, которые кодируют факторы разделения, и дефицит самих факторов приведут к избыточному слиянию митохондрий. При дефектах в белках, ответственных за слияние митохондрий, мы будем наблюдать их избыточную фрагментацию. Нарушение слияния митохондрий в конечном счете может привести к мутациям в митохондриальной ДНК и появлению органелл с измененной функцией. Прежде всего, это касается процессов окислительного фосфорилирования.

Нарушения в динамике митохондрий при отдельных нейродегенеративных заболеваниях:

Все изменения в функции митохондрий нельзя объяснить исключительно нарушениями их динамики. Первичные метаболические нарушения при нейродегенеративных заболеваниях (см. табл. 1) могут вмешаться в работу митохондрий и сами по себе.

Ключевой «цех» митохондрий, который активно производит АТФ — это дыхательная цепь переноса электронов (рис. 2). Она состоит из четырех комплексов, расположенных на внутренней мембране митохондрии [17].

Рисунок 2. Строение дыхательной цепи в митохондриях. C I — комплекс I (NADH-дегидрогеназный комплекс); C II — комплекс II (сукцинатдегидрогеназа); C III — комплекс III (цитохром-bc₁-комплекс); C IV — комплекс IV (цитохром-с-оксидаза); Cyt C — цитохром C.

При нейродегенеративных заболеваниях нарушения распространяются не на всю дыхательную цепь, а на отдельные ее элементы, снижая эффективность их работы [18]:

Итогом сбоя в одном элементе становится нарушение работы всей цепи.

Заглянуть внутрь батарейки

В настоящее время существует множество способов, которые позволяют оценить работу митохондрий [19]. Все их можно условно поделить на три группы: изучение изолированных митохондрий, изучение митохондрий в целых клетках и изучение синаптосом.

Изучение изолированных митохондрий

Этот метод позволяет прицельно изучить саму органеллу, но при этом мы не можем полностью оценить воздействие цитозольных факторов на функцию митохондрий. Как правило, выделение митохондрий проводят центрифугированием при низких температурах (0–2 градуса по Цельсию) [20]. Функцию митохондрий оценивают по их способности поглощать кислород, по соотношению окисленных и восстановленных метаболитов. Также отдельно можно изучить активность ферментов дыхательной цепи и синтез АТФ в митохондриях. Эти данные дают подробное представление о том, какие метаболические процессы нарушены внутри органелл, и указывают на возможные пути коррекции нарушений функции митохондрий.

Изучение митохондрий в целых клетках

Здесь трудность кроется в том, что часть веществ, необходимых для оценки работы митохондрий, не проникает через мембрану клетки. Частично это ограничение может быть снято при помощи увеличения проницаемости клеточной мембраны, но это повышает риск повреждения клетки. Для оценки митохондриальной функции у живых клеток измеряют концентрацию и парциальное давление кислорода в ткани или культуре клеток, скорость его потребления.

Изучение синаптосом

В каком-то смысле синаптосома занимает промежуточное положение между целой клеткой и отдельной митохондрией. Выделение синаптосом происходит из гомогенизированной ткани мозга, и она представляет собой изолированный участок аксона нервной клетки с пресинаптическим участком. Синаптосома содержит в себе везикулы с нейромедиатором и митохондрии. Также целой остается пресинаптическая мембрана с комплексом ионных каналов и рецепторов. Активная часть постсинаптической мембраны тоже может попасть при выделении в состав синаптосомы (рис. 3).

Рисунок 3. Варианты синаптосом, которые могут быть получены в ходе их выделения.

Синаптосома — это удобный объект для изучения синаптических нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение синаптосом не заменяет другие методы, но дополняет их и уточняет полученные ими данные. Синаптосома — уникальный объект для изучения клеточной функции нейронов и позволяет отдельно оценить роль митохондрий в поддержании работы синапса: при исследовании синаптосом можно оценить концентрацию метаболитов, связанных с активностью митохондрий.

Исследование синаптосом при заболеваниях нервной системы началось в конце 70-х годов XX века [21]. В 1980-х гг. при изучении синаптосом у пациентов с болезнью Альцгеймера был обнаружен дефицит ацетилхолиновой [22], глутаматергической [23] и ГАМК-ергической [24] трансмиссий (передач сигнала). Исследование болезни Альцгеймера оказалось подходящим для разработки основных подходов в изучении синаптосом. Во-первых, количество пациентов, страдающих этим расстройством, велико, что позволяет собрать большое количество материала для исследования. Во-вторых, прогрессирование расстройства в бóльшей степени связывают с нарастающим снижением количества синапсов в мозге [25].

Однако анализ синаптосом может помочь не только в изучении болезни Альцгеймера. При помощи этого метода обнаружили, что мутантный белок HTT при болезни Гентингтона подавляет транспорт митохондрий [26]. Изучение синаптосом приложимо и в случае деменции с тельцами Леви [27].

Все три традиционных метода диагностики метаболической функции митохондрий дают много полезной информации, но при этом обладают рядом недостатков:

Эти сложности подтолкнули индустрию к поискам новых решений.

Тест-драйв митохондрий

Одним из самых перспективных методов для исследования митохондриальной функции является их изучение анализатором внеклеточных потоков (extracellular flux, XF). Такой прибор позволяет оценить показатели митохондриального дыхания и гликолиза в отдельных митохондриях, в синаптосомах и в целых клетках с применением пермеабилизующих (повышающих проницаемость мембраны) реагентов.

Оценка митохондриального дыхания методом XF

Оценку проводят по четырем параметрам:

Митохондриальное дыхание оценивается по скорости поглощения кислорода (oxygen consumption rate, OCR). Существует представление о стрессовом профиле митохондриального дыхания (рис. 4). Для его формирования в исследуемые образцы поэтапно добавляют вещества-разобщители дыхательной цепи, или митохондриальные ингибиторы (см. врезку). При нормальном функционировании митохондрий они выявят метаболические резервы органелл. Например, добавление ротенона и антимицина нарушает работу комплексов I и III соответственно, заставляя работать другие элементы цепи в полную силу. В этом и есть исследовательская ценность метода XF: мы можем точно узнать, в какой части дыхательной цепи случилась «поломка», проверяя на прочность каждый из участков. Если же ингибиторы дыхания добавлять к образцам, где есть митохондрии, затронутые патологическим процессом, это позволит выявить «слабые» места метаболических реакций. Без дополнительной стимуляции эти нарушения трудно обнаружить, но стресс-тест для митохондрий выявит его. Получаемый при исследованиях тестовых культур профиль сравнивают со стандартным, чтобы получить данные о дефектах клеточного дыхания.

Рисунок 4. Исследование митохондриального дыхания. На рисунке представлен стандартный стрессовый профиль реакции при изучении митохондриального дыхания, которая контролируется по скорости поглощения кислорода. Добавление различных разобщителей дыхательной цепи и метаболически активных веществ в течение опыта позволяет оценить параметры митохондриального дыхания. Желтая линия показывает изменения скорости поглощения кислорода при разных условиях, а цветные столбики являются производными от этих изменений.
Например, добавление карбонилцианид-4-(трифлуорометокси)фенилгидразона (FCCP) нарушает синтез АТФ. За счет «контрабанды» протонов мимо АТФ-синтазы из межмебранного пространства в матрикс электрохимический потенциал исчезает, и синтез АТФ постепенно снижается до нуля. Это разрывает процесс окислительного фосфорилирования, «заставляя» митохондрии работать на полную мощность. Они вынуждены «выталкивать» избыток протонов в межмембранное пространство, что приводит к увеличению потребления кислорода до максимума. Олигомицин нарушает фосфорилирование АДФ и его введение в образец снижает синтез АТФ. На рисунке это отражается как уменьшение скорости поглощения кислорода митохондриями. Запасная дыхательная емкость рассчитывается как разница между максимальным и базальным дыханиями.

рисунок предоставлен компанией «Биохиммак»

Митохондриальные ингибиторы, применяемые в стресс-тестах

Например, при добавлении в исследуемые образцы синаптосом нейронов ингибиторов комплексов I и II (ротенона и 3-нитропропионовой кислоты соответственно) отмечали резкое снижение показателей максимального дыхания, что моделировало болезни Паркинсона и Гентингтона [28]. Следовательно, нарушения в работе этих комплексов являются важным компонентом в развитии указанных нейродегенеративных заболеваний.

Также митохондриальную функцию можно оценивать и у целых клеток. Для создания модели болезни Паркинсона у модельных клеток подавляли продукцию митохондриальной аконитазы (m-аконитазы) [29]. Mитохондриальная аконитаза участвует в цикле Кребса, превращая цитрат в изоцитрат. Кроме этого она ответственна за поставку электронов (в виде NADH) для дыхательной цепи. Снижение функции m-аконитазы приводит к дефициту электронов. Как следствие, кислород не переходит в связанное состояние в комплексе IV, и его потребление снижается. При сравнении двух дыхательных профилей (рис. 5) становится очевидно, что у модельных клеток снижено базальное дыхание (часть графика до добавления олигомицина) и респираторная емкость (часть графика между добавлением FCCP и антимицина А (AA).

Рисунок 5. Тестовое определение базального дыхания и дыхательной емкости у контрольной группы клеток в сравнении с модельными клетками при болезни Паркинсона (пояснения в тексте).

Если мы возьмем клетки реальных пациентов с болезнью Паркинсона, проведем их исследование с добавлением тех же реактивов в том же порядке и получим такие же результаты, то сможем сказать, что нарушения в работе этих нейронов, возможно, связаны с дисфункцией m-аконитазы. Здесь у нас открывается возможность для тестирования препаратов: мы можем исследовать образцы нейронов с потенциальными препаратами, добавляя к ним олигомицин, FCCP и антимицин A. Потенциально успешные препараты будут демонстрировать эффект в виде приближения кривой к нормальным показателям.

Такие эксперименты уже проводят. Например, метод XF позволил оценить нейропротекторный эффект меклизина при его использовании на клеточных моделях болезни Гентингтона [30]. Меклизин относится к противорвотным препаратам с антигистаминовой и антихолинергической активностью. Добавление меклизина к клеточным культурам с мутантным белком, отвечающим за развитие болезни Гентингтона, увеличило выживаемость клеток. При этом эффект реализовывался именно за счет нормализации процессов клеточного дыхания: меклизин может уменьшать образование эндогенных окисленных продуктов [31] и препятствовать высвобождению цитохрома C из митохондрий [32].

Оценка гликолиза методом XF

Кроме оценки митохондриального дыхания, методом XF можно оценить различные показатели гликолиза (рис. 6):

Ситуация здесь схожа с той, что обсуждалась при изучении митохондриального дыхания. Гликолитическую активность митохондрий оценивают по скорости внеклеточного закисления (extracellular acidification rate, ECAR).

Рисунок 6. Исследование показателей гликолиза (стандартный стрессовый профиль реакции). Гликолиз косвенно оценивают по изменению pH среды. Добавление метаболически активных веществ, как и в случае с митохондриальным дыханием, позволяет изменять интенсивность процесса гликолиза, что и фиксируют при исследовании. Черная кривая с точками демонстрирует эти изменения, а цветные столбики являются производными от них. Добавление к исследуемым образцам 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG) подавляет гликолитическую активность, в то время как раствор глюкозы и олигомицин значительно усиливают ее.

рисунок предоставлен компанией «Биохиммак»

Добавление различных субстратов проверяет на прочность метаболическую активность митохондрий, выявляя уязвимые места. Где тонко, там и рвется — метод XF ищет «тонкие» места в метаболизме митохондрий, потенциально указывая на то, что они могут быть усилены при помощи лекарств. Допустим, мы нашли, что при определенной патологии поражается комплекс III дыхательной цепи. Значит, поиск лекарства будет связан с выбором вещества, которое усиливает активность этого компонента и приводит к повышению выживаемости клеток, как это было показано выше в примере с миклезином и болезнью Гентингтона.

Инструмент для мастера

Качественное исследование в молекулярной биологии требует современного оборудования. Метод XF, изобретенный в 2006 году, используется в анализаторах компании Seahorse Bioscience (a part of Agilent Technologies, США). Оборудованием для анализа клеточного метаболизма, которое производит эта компания, пользуются ведущие мировые лаборатории. Счет исследованиям, при проведении которых использовали эти анализаторы, идет на сотни. В анализаторах Seahorse можно изучать параметры гликолиза и клеточного дыхания в 3D-культурах клеток, отдельных клетках, митохондриях и синаптосомах. Кроме того, для анализа могут быть использованы целые инсулярные островки поджелудочной железы.

Процедура исследования автоматизирована: необходимо только поместить изучаемые образцы в специальную планшетку и заполнить отделение для реагентов. Анализ метаболических показателей проводится благодаря твердофазным оптическим сенсорам, которые не повреждают клеточную культуру, и она может быть использована повторно в экспериментах. Те части прибора, которые контактируют с исследуемыми образцами, являются одноразовыми и не требуют отмывки. На саму процедуру анализа прибором уходят минуты, но получаемая информация обладает высокой точностью. Колебания давления кислорода оцениваются с чувствительностью в 0,67 mmHg (миллиметров ртутного столба); также прибор фиксирует изменение содержания ионов водорода на уровне пикомолей. При этом аппарат способен одновременно оценить клеточное дыхание и обмен глюкозы. Клеточное дыхание измеряется по уровню потребления кислорода, а обмен глюкозы — по уровню продукции протонов водорода в изучаемых образцах. Двух этих параметров достаточно, чтобы полноценно оценить метаболическую функцию клетки и ее нарушения.

Благодаря системе автоматических инъекционных портов в ходе измерений может быть добавлено до четырех веществ, влияющих на метаболизм — ингибиторы клеточного дыхания, различные токсины и цитопротекторы. Учитывая то, что в одном планшете одновременно можно тестировать до 96 образцов, исследовательские возможности прибора становятся просто колоссальными. О производительности и качестве приборов говорит и то, что их использовали в Национальной программе США по исследованию токсических веществ, где анализу подвергли более 1300 химических соединений [33].

Если говорить о компонентах для анализа, то готовые реагенты поставляет сама компания Seahorse, в том числе и реагенты для контроля состояния приборов. Расход реагентов при процедуре анализа методом XF ниже, чем при традиционных методах. Это достигается за счет того, что клеток для работы требуется в 10–20 раз меньше.

Если сравнивать XF-анализаторы митохондриального метаболизма с приборами на основе других методов, то можно отметить ряд несомненных преимуществ. Одним из способов измерения концентрации кислорода при исследовании митохондрий является использование электродов Кларка или автоматизированной аппаратуры на их основе — оксиграфов. Главный их недостаток — необходимость большого количества материала для исследования, что исключает изучение синаптосом. Масс-спектрометрия и газовая хроматография дóроги и требуют длительной подготовки анализируемого материала. Это усложняет их применение на практике. Еще одно преимущество XF-анализиторов — это способность одновременно измерять динамику pH и концентрацию кислорода в пробах, что дает исследователю комплексное представление о метаболизме глюкозы и митохондриальном дыхании.

Заключение

Как показывает множество исследований, при нейродегенеративных заболеваниях происходит значительное нарушение функции митохондрий. Может нарушаться их движение внутри нейрона, а также процессы их слияния и разделения. Такие изменения приводят к нарушению метаболических процессов, протекающих внутри этих органелл: клеточного дыхания и гликолиза. Их можно косвенно оценить по колебаниям концентрации кислорода и pH. В этом поможет высокоточный и надежный метод анализа внеклеточных потоков — XF (extracellular flow). Он позволяет изучать как живые клетки, так и отдельные митохондрии и синаптосомы. Исследование метаболической активности митохондрий дает информацию, которая позволяет не только пролить свет на патогенез заболевания, но и выяснить, какие лекарственные средства будут эффективны для их лечения.

ЗАО «БиоХимМак» — спонсор спецпроекта по биоэнергетике

Отдел молекулярной диагностики (Life Science MDx) «БиоХимМак» предлагает высокотехнологичные инструменты для решения научных и диагностических задач в областях молекулярной и клеточной биологии, генетики и биотехнологии. В сферу наших интересов входят:

Наши сотрудники оказывают помощь

Мы осуществляем

Мы работаем

Анализаторы Seahorse (Agilent Technologies, США)

Seahorse — один из самых передовых исследовательских инструментов, «золотой стандарт» в изучении клеточного метаболизма:

Материал предоставлен партнёром — компанией «БиоХимМак»

Источник